Doc-1基因編碼蛋白p12某些結構和功能的預測及相關人舌鱗癌(Tca-8113)細胞cDNA文庫的構建.pdf

1、癌癥是一類嚴重威脅人類健康、導致死亡的常見病、多發(fā)病，是近年來醫(yī)學領域中研究的重要課題之一。而口腔癌的發(fā)生率排在世界癌發(fā)生率的第六位。近年來隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，從分子水平上研究腫瘤發(fā)生的機制及其與癌基因、抑癌基因的關系已成為腫瘤基因治療的主要方向之一。癌癥的發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關?？谇话┤笔?1（deletedinoralcancer-1,DOC-1）基因是Todd等于1995年利用倉鼠口腔癌模型分離和證實

2、的一個候選抑癌基因，p12蛋白是其編碼的具有腫瘤生長抑制功能的蛋白。作為一種新的候選抑癌基因逐年受到醫(yī)學研究者的關注。人類DOC-1位于染色12q24，cDNA全長為1627bp，編碼115個氨基酸，具有4個外顯子，p12分子量為12.4kDa。DOC-1可以誘導倉鼠口腔惡性角化細胞的凋亡。p12蛋白通過兩種重要的細胞伴侶（細胞周期依賴性蛋白激酶2和DNA聚合酶α）而對細胞周期中的S期進行調控。p12蛋白是一種CDK2的相關蛋白，對激酶

3、的活性起負調控作用，并通過下調活性CDK2的表達水平，減弱對Rb基因活性的抑制，從而抑制腫瘤的生長，并且在鱗狀細胞癌中異位表達p12后可以轉變細胞系的惡性表型，部分是因為p12與CDK2和DNA聚合酶α結合，從而抑制了他們的活性。p12蛋白在人口腔鱗癌中的表達顯著降低甚至缺失，但其缺失的機理和水平尚未見報道。
　　本研究采用生物信息學數據庫及相關軟件預測DOC-1基因編碼蛋白p12的理化性質、二級結構和可能存在的功能位點，構建人舌

4、鱗癌（Tca-8113）細胞cDNA文庫，運用酵母雙雜交技術篩選與p12蛋白相互作用的蛋白，從而發(fā)現(xiàn)導致p12蛋白在口腔癌缺失中的相關因子，進一步闡明DOC-1基因缺失的機理，為下一步研究DOC-1的功能奠定了基礎。
　　實驗目的：
　　本課題研究的目的是通過構建人舌鱗癌(Tca-8113)細胞cDNA文庫，用生物信息學技術預測p12蛋白的理化性質和高級結構以及可能與其相互作用的因子，為下一步運用酵母雙雜交技術篩選出新的蛋白

5、，研究DOC-1基因及其蛋白在口腔癌發(fā)生中的作用與調控機制提供重要工具。
　　實驗方法：
　　1.使用生物信息學技術相關數據庫和軟件預測DOC-1基因編碼的p12蛋白的某些結構和功能基序，尋找可能與其相互作用的因子。查詢GenBank數據庫得到DOC-1基因的堿基序列和p12蛋白的氨基酸序列；通過http://www.expasy.org/tools/＃proteome得到p12的理化性質；由TMHMM站點http://ww

6、w.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/了解該基因編碼的蛋白質是否具有跨模結構；由PSORT主頁的http://psort.nibb.ac.jp/預測其亞細胞定位。通過ExPASy的http://www.expasy.org/及Jpred的http://www.compbio.dundee.ac.uk/～www-jpred/得到p12可能的功能基序和功能位點以及二級結構（α螺旋、β折疊、β轉角以及無規(guī)卷曲等）的預測和分析

7、。2.構建人舌鱗癌（Tca-8113）細胞cDNA文庫。用Trizol法提取人舌鱗癌（Tca-8113）細胞的總RNA，使用OligotexmRNAMiniKit分離純化mRNA，使用LibraryConstructionKitandcDNASynthesisKit構建人舌鱗癌（Tca-8113）細胞cDNA表達文庫。
　　實驗結果：
　　獲得了p12蛋白的外顯子和理化性質信息，預測了可能存在的功能基序及二級結構，人舌鱗癌（