DOC-1基因在口腔鱗癌中的表達(dá)差異及p12DOC-1外源性表達(dá)對(duì)Tca8113細(xì)胞的影響.pdf

1、口腔癌是口腔頜面部最常見的腫瘤，其發(fā)病部位位于體表或接近體表部位，故嚴(yán)重影響患者正常的生理功能及社會(huì)交往。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，許多疾病的發(fā)生、發(fā)展都已經(jīng)從基因水平上得到相應(yīng)的解釋。癌基因與抑癌基因的突變、失活、表達(dá)異常是癌癥發(fā)生的主要原因，近年來一些與口腔癌相關(guān)的基因被相繼發(fā)現(xiàn)，為從分子水平上研究口腔癌的發(fā)生、發(fā)展提供了可能?？谇话┤笔Щ?（deletedinoralcancer-1,DOC-1）是哈佛大學(xué)Todd于1995

2、年在倉鼠口腔上皮中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)候選抑癌基因，p12蛋白是該基因編碼的蛋白產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)p12蛋白具有抑制腫瘤生長的功能。人類DOC-1位于染色體12q24，cDNA全長為1627bp,編碼115個(gè)氨基酸,蛋白產(chǎn)物分子量為12.4kDa。
　　目的
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同分化程度的口腔鱗癌中p12蛋白的表達(dá)量有差異，本課題研究的目的是通過半定量RT-PCR的方法，來觀察DOC-1基因在不同分化程度的口腔癌中mRNA的表達(dá)

3、含量是否有區(qū)別。構(gòu)建DOC-1基因ORF編碼區(qū)的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染舌癌Tca8113細(xì)胞株，觀察外源性表達(dá)的p12蛋白對(duì)舌癌Tca8113細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。
　　方法
　　1.通過設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT-PCR的方法檢測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌和正常口腔粘膜組織中DOC-1基因mRNA的表達(dá)。所得產(chǎn)物電泳后經(jīng)計(jì)算機(jī)凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定每個(gè)產(chǎn)物的灰度值，通過與內(nèi)參照的灰度值進(jìn)行對(duì)比得到每個(gè)產(chǎn)物的一個(gè)相對(duì)值，再對(duì)得到的相對(duì)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)

4、分析。2.設(shè)計(jì)針對(duì)人DOC-1基因ORF編碼區(qū)的引物，從HaCaT(人永生化表皮細(xì)胞)中克隆出ORF編碼區(qū)序列，在序列兩端連入相應(yīng)的特異性酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序，成功構(gòu)建含有DOC-1基因ORF編碼區(qū)的真核表達(dá)載體。3.將構(gòu)建好的含有DOC-1基因ORF編碼區(qū)的真核表達(dá)載體通過轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染舌癌Tca8113細(xì)胞株，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后測(cè)定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞侵襲能力，觀察外源性表達(dá)的p12蛋白對(duì)舌癌Tca8113細(xì)胞的生物學(xué)行

5、為的影響。
　　結(jié)果
　　1.DOC-1基因mRNA在口腔癌中的灰度值為1.22±0.12，在口腔粘膜中的灰度值為1.58±0.15；DOC-1mRNA在高分化口腔癌中的灰度值為1.35±0.04，在中分化口腔癌中的灰度值為1.20±0.05，在低分化口腔癌中的灰度值為1.08±0.03。2.構(gòu)建好的載體經(jīng)雙酶切、電泳、測(cè)序鑒定，表明含有DOC-1基因ORF編碼區(qū)的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-DOC-1構(gòu)建成功。3.篩選出

6、的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞比較，細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力也降低，且與對(duì)照組細(xì)胞相比，改變具有顯著性。
　　結(jié)論
　　本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DOC-1基因mRNA的表達(dá)量在不同分化程度的口腔鱗癌中有差異，口腔鱗癌分化程度越低，DOC-1基因mRNA的表達(dá)量也越低。DOC-1基因可能在口腔鱗狀細(xì)胞癌早期具有重要作用，DOC-1基因mRNA的低表達(dá)可能是口腔鱗狀細(xì)胞癌中的早期事件。成功構(gòu)建了含有DOC-1基因ORF編碼區(qū)的真核表達(dá)