束骨姜黃醇對(duì)Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用及其對(duì)COX-2和iNOS表達(dá)的影響.pdf

1、目的：口腔頜面部癌癥的發(fā)病率約占全身惡性腫瘤發(fā)病率的5-10％，因?yàn)榭谇活M面部特殊的解剖位置，目前口腔癌患者的五年生存率僅為50％左右，它嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康。在這其中，約有90％的口腔癌為上皮源性，即口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous carcinoma cell，OSCC)。舌體是口腔頜面部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率最高的部位，約占口腔癌40％以上。舌癌發(fā)病率在男性約為0.5～0.6/10萬，女性約為0.4～0.5/10萬，近年

2、來，隨著生活環(huán)境的變化，人類舌癌的發(fā)病率沒有減少，反呈明顯逐年上升的趨勢(shì)，同發(fā)病年齡也日趨低齡。目前舌癌的治療仍是以手術(shù)為首選，并輔以局部放療和全身化療的綜合治療，但手術(shù)造成的功能障礙和外貌畸形對(duì)患者來說是不愿承受的，而放化療對(duì)患者機(jī)體也存在著嚴(yán)重的毒副作用，因而尋一種找積極有效并且毒副反應(yīng)低的治療藥物成為一項(xiàng)十分迫切的重要任務(wù)。
　　 束骨姜黃醇(xanthorrhizol)最早是由German Rimpler于1970年自束

3、骨姜黃(Curcuma xanthorrhiza)中所分離出來的一種倍半萜類化合物（sesquiterpene compound）。束骨姜黃醇已證明具有多種的生物活性，如抗菌和抗真菌活性，抗炎抗氧化作用等。其抗腫瘤作用亦是近年來研究熱點(diǎn)之一，現(xiàn)研究已證明束骨姜黃醇能對(duì)包括乳腺癌，結(jié)腸癌在內(nèi)的多種癌細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)能抑制多種腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　 COX-2及iNOS是目前研究較多的兩種基因蛋白分子，兩者在惡性腫瘤

4、的發(fā)生發(fā)展具有關(guān)鍵性的促進(jìn)作用，目前研究發(fā)現(xiàn)，COX-2、iNOS在包括舌癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中表達(dá)呈顯著正相關(guān)，而其聯(lián)合表達(dá)與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，可能共同影響腫瘤的血管生成，參與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。兩者之間存在著較為密切的關(guān)系，能夠被生長(zhǎng)因子、紫外線、細(xì)胞因子、某些化學(xué)藥物等激活，其作用位點(diǎn)是目前治療惡性腫瘤的重要靶點(diǎn)之一。
　　 本實(shí)驗(yàn)研究用一定濃度的束骨姜黃醇干預(yù)Tca8113細(xì)胞，觀察其對(duì)Tca8113細(xì)胞的生

5、長(zhǎng)抑制作用及相應(yīng)COX-2、iNOS蛋白表達(dá)變化情況，同時(shí)對(duì)束骨姜黃醇聯(lián)合氟尿嘧啶(5-Fu)對(duì)Tca8113細(xì)胞的影響作用進(jìn)行了初步的探索，為臨床研究提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：將復(fù)蘇后的舌癌Tca8113細(xì)胞置于37℃，5％CO2飽和濕度的常規(guī)條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。
　　 1.束骨姜黃醇對(duì)Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及蛋白表達(dá)測(cè)定
　　 1.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖抑制：按實(shí)

6、驗(yàn)分組，實(shí)驗(yàn)組中，加入不同劑量的束骨姜黃醇溶液，使其終濃度為10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μ,mol/L，設(shè)空白調(diào)零組，不接種細(xì)胞，設(shè)空白對(duì)照組，只加等量培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，繼續(xù)將培養(yǎng)板移入恒溫培養(yǎng)箱中原條件下培養(yǎng)72h，分別在24h、48h、72h檢測(cè)每孔細(xì)胞的OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。
　　 1.2 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)COX-2、iNOS基因蛋白的表達(dá)情況：收集經(jīng)不同濃度束骨姜黃醇(20μmo

7、l/L、40μmol/L、60μmol/L)作用0h、12h、24h、48h、72h的舌癌Tca8113細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，按常規(guī)方法進(jìn)行熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以平均熒光強(qiáng)度道數(shù)表示蛋白的表達(dá)量。
　　 2.束骨姜黃醇聯(lián)合氟尿嘧啶對(duì)Tca8113細(xì)胞的抑制作用(具體方法同1.1)
　　 2.1 取不同時(shí)間點(diǎn)及不同劑量的氟尿嘧啶單藥溶液干預(yù)Tca8113細(xì)胞，其終濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmo

8、l/L、40μmol/L，測(cè)得其24h、48h、72h內(nèi)抑制率。
　　 2.2 在原束骨姜黃醇單一用藥基礎(chǔ)上加入10μmol/L氟尿嘧啶，檢測(cè)每孔細(xì)胞的OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，并測(cè)得兩藥聯(lián)合應(yīng)用的相互作用指數(shù)。
　　 2.3 在原氟尿嘧啶單一用藥基礎(chǔ)上加入20μmol/L束骨姜黃醇，檢測(cè)每孔細(xì)胞的OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，并測(cè)得兩藥聯(lián)合應(yīng)用的相互作用指數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 1.束骨姜黃醇對(duì)Tca

9、8113細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及相關(guān)蛋白表達(dá)影響
　　 1.1 束骨姜黃醇對(duì)Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響
　　 1.1.1 OD值：不同濃度的束骨姜黃醇干預(yù)Tca8113細(xì)胞后，除24h同48h組無顯著性差異外(P=0.09＞0.05)，其余各濃度時(shí)間組均有顯著性差異(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明束骨姜黃醇對(duì)Tca8113細(xì)胞OD值的影響在時(shí)間與濃度之間有交互作用。生長(zhǎng)曲線顯示：作用時(shí)間相同，束骨姜黃醇濃度越高，生長(zhǎng)曲線越低

10、；藥物濃度相同，隨著作用時(shí)間增加，生長(zhǎng)曲線相對(duì)平緩，濃度和時(shí)間有交互性，藥物濃度越大，作用時(shí)間越長(zhǎng)，生長(zhǎng)曲線壓低越明顯。
　　 1.1.2 抑制率：隨著束骨姜黃醇濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸增高，作用時(shí)間相同，101imol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L束骨姜黃醇抑制率的平均數(shù)分別為11.04％、17.84％、26.92％、40.45％，隨濃度增加，抑制率顯著增加，作用濃度相同，24h、48h、72

11、h抑制率的平均數(shù)分別為14.57％、25.47％、32.14％，隨時(shí)間增加，抑制率增加，各濃度組間比較，存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)；各干預(yù)時(shí)間組間比較，存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。24h、48h、72h IC50值分別為85.11μmol/L、60.26μmol/L、48.99μmol/L，隨濃度增加IC50顯著降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明濃度越高，干預(yù)時(shí)間越長(zhǎng)，抑制率越大，呈顯著濃度-時(shí)間依賴性關(guān)系。
　　 1.2 FC

12、M檢測(cè)束骨姜黃醇作用于舌癌Tca8113細(xì)胞后COX-2、iNOS蛋白的表達(dá)。
　　 1.2.1 COX-2蛋白平均熒光強(qiáng)度：在時(shí)間因素方面，各組蛋白表達(dá)差異均具有顯著性(P＜0.01)；這提示著束骨姜黃醇隨著其對(duì)Tca8113影響時(shí)間的增加，COX-2蛋白表達(dá)持續(xù)降低；在濃度因素方面，隨著束骨姜黃醇用藥濃度的增加，COX-2蛋白表達(dá)持續(xù)降低，各組間比較均有顯著性差異(P＜0.01)，提示濃度梯度對(duì)COX-2蛋白的表達(dá)具有較強(qiáng)相

13、關(guān)性。根據(jù)線性關(guān)系隨著束骨姜黃醇藥物濃度、作用時(shí)間的增加，COX-2蛋白的表達(dá)逐漸降低。
　　 1.2.2 iNOS蛋白平均熒光強(qiáng)度：在時(shí)間因素方面，48h組與72h組相比，無顯著性差異(P=0.076＞0.05)，除此之外，束骨姜黃醇隨著其對(duì)Tca8113影響時(shí)間的增加，iNOS蛋白表達(dá)降低。在濃度因素方面，隨著束骨姜黃醇用藥濃度的增加，iNOS蛋白表達(dá)持續(xù)降低，各組間比較均有顯著性差異(P＜0.01)，提示濃度梯度對(duì)iNOS

14、蛋白的表達(dá)具有較強(qiáng)相關(guān)性。根據(jù)線性關(guān)系隨著束骨姜黃醇藥物濃度、作用時(shí)間的增加，iNOS蛋白的表達(dá)逐漸降低。
　　 生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)及COX-2、iNOS結(jié)果均表明束骨姜黃醇對(duì)Tca8113細(xì)胞有明顯的的抑制作用。
　　 2.束骨姜黃醇聯(lián)合氟尿嘧啶對(duì)Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響
　　 2.1 不同劑量的5-Fu作用24h、48h、72h對(duì)Tca8113細(xì)胞的抑制作用隨時(shí)間及濃度的增長(zhǎng)而增加，說明5-Fu單獨(dú)作用于

15、Tca8113細(xì)胞的抑制率隨藥物濃度的增長(zhǎng)及處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，即5-Fu對(duì)Tca8113細(xì)胞的抑制效應(yīng)呈劑量和時(shí)間依賴性關(guān)系。
　　 2.2 在應(yīng)用10μmol/L氟尿嘧啶后，束骨姜黃醇在24h、48h、72h時(shí)IC50值由單一用藥時(shí)85.11μmol/L、60.26μmol/L、48.99μmol/L，下降到46.22μmol/L、33.4μmol/L、26.71μmol/L，氟尿嘧啶與各個(gè)濃度的束骨姜黃醇聯(lián)用時(shí)，皆為為協(xié)

16、同相加及增強(qiáng)關(guān)系，在中低濃度尤其明顯。
　　 2.3 在應(yīng)用20μmol/L束骨姜黃醇后，氟尿嘧啶在24h、48h、72h中IC50由單一用氟尿嘧啶時(shí)39.04μmol/L、32.23μmol/L、28.68μmol/L，下降到24.94μmol/L、17.06μmol/L、13.55μmol/L，束骨姜黃醇與20μmol/L的氟尿嘧啶合用時(shí)，皆為為協(xié)同相加及增強(qiáng)關(guān)系，抗增殖的作用均明顯加強(qiáng)，在中低濃度尤其明顯。
　　

17、結(jié)論：
　　 1.束骨姜黃醇能明顯的抑制舌癌細(xì)胞Tca8113細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖，其抑制效應(yīng)同束骨姜黃醇的濃度梯度及作用時(shí)間有較為密切的關(guān)系。
　　 2.束骨姜黃醇能較為明顯的抑制舌癌細(xì)胞Tca8113細(xì)胞COX-2及iNOS蛋白表達(dá)，其對(duì)兩種蛋白抑制效應(yīng)同束骨姜黃醇的濃度梯度及作用時(shí)間皆有較為密切的關(guān)系。
　　 3.Tca8113中COX-2及iNOS蛋白表達(dá)在束骨姜黃醇干擾時(shí)具有其相應(yīng)聯(lián)動(dòng)效應(yīng)，提示其二者之間存