人細胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白的重組表達及在牙本質(zhì)形成中的作用和機理研究.pdf

1、MEPE，又名成骨細胞/骨細胞因子45（Osteoblast/OsteocyteFactor45；OF45）或是Osteoregulin。2000年，Rowe在篩選腫瘤性低血磷性骨軟化癥（oncogenichypophosphatemicosteomalacia，OHO）患者腫瘤組織cDNA文庫中表達上調(diào)的基因時，發(fā)現(xiàn)了MEPE。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，正常組織中，MEPE在骨髓和大腦中表達，肺、腎和胎盤中的表達水平很低。同年，Peter

2、sen等在大鼠骨髓源性的成骨細胞中克隆到MEPE基因，Northernblot和免疫組織化學研究顯示：MEPE僅在骨組織中表達，特別是骨小梁和皮質(zhì)骨中的骨細胞呈高表達。2003年，Gowen等克隆了小鼠MEPE基因，發(fā)現(xiàn)其上游存在三個蛋氨酸密碼子，可以選擇性轉(zhuǎn)錄起始，最大可編碼441個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。Northern和Westernblot顯示MEPE在骨組織和成牙本質(zhì)細胞中表達。目前在口腔醫(yī)學領(lǐng)域MEPE的研究還是處于初期，對于M

3、EPE的功能我們還知之甚少。前期研究提示MEPE可能參與牙本質(zhì)形成。本課題通過MEPE基因克隆、原核以及真核蛋白表達等方法，在mRNA和蛋白質(zhì)的水平上，從MEPE的表達、在牙齒細胞中功能以及在羥基磷灰石晶體形成和生長中作用等幾個方面，全面深入地研究MEPE參與牙本質(zhì)基質(zhì)形成和礦化的過程、作用和機理等。這將闡明MEPE在牙本質(zhì)牙髓復合體形成和損傷修復中的機制，豐富牙髓生物學和牙齒發(fā)育生物學，并為臨床上生活牙髓的保存治療和組織工程化牙本質(zhì)修

4、復牙體組織缺損提供理論基礎(chǔ)
　　本研究分為以下5個部分內(nèi)容：
　　一、MEPE基因克隆和序列分析
　　利用PCR技術(shù)，設(shè)計一對引物從人腦cDNA文庫中擴增出MEPE編碼區(qū)基因片段(約1.5kb)，將擴增的基因片段插入pGEM-TEasy克隆載體，限制性酶切進行鑒定并進行核苷酸序列測定。結(jié)果表明：克隆到人MEPE蛋白編碼區(qū)基因片段，序列與GenBank中收錄的人MEPEcDNA序列一致。
　　二、MEPE基因在原核

5、和真核細胞中的表達
　　將MEPE編碼區(qū)全長片段亞克隆至表達載體pGEX-4T-1中，大腸桿菌中誘導表達，純化后獲得人MEPE蛋白。以重組、純化的MEPE為抗原，混入完全/不完全弗氏佐劑，免疫新西蘭大白兔，制備MEPE多克隆抗體。
　　分別將MEPE基因亞克隆入非融合和融合真核表達載體pcDNA3.1和pEGFP-C3中，脂質(zhì)體介導將載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞COS-7，通過免疫組織化學、WesternBlot等方法檢測MEPE蛋

6、白在哺乳動物細胞中的表達。發(fā)現(xiàn)表達的綠色熒光蛋白融合蛋白所發(fā)出的熒光位于細胞漿中，胞核中無熒光，與免疫組化結(jié)果一致，說明MEPE位于細胞漿中。WesternBlot檢測顯示在COS-7細胞中表達的MEPE的分子量為61kDa，與理論值相符。
　　三、MEPE蛋白的組織表達特性研究
　　用制備的抗人MEPE蛋白抗體對狗牙胚組織切片進行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)成牙本質(zhì)細胞染色陽性，前期牙本質(zhì)染色陽性，牙髓細胞染色陰性。
　　四、

7、MEPE蛋白對牙髓細胞和牙周膜細胞的生物學作用
　　采用四唑鹽比色法觀察了MEPE蛋白對人牙周膜細胞、牙髓細胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEPE蛋白對牙周膜細胞增殖無促進作用、對牙髓細胞的增殖有促進作用。酶動力學方法觀察了MEPE蛋白對人牙周膜細胞、牙髓細胞ALP活性的影響。研究結(jié)果表明，MEPE蛋白可提高牙髓細胞、牙周膜細胞的ALP活性。Vonkossa染色結(jié)果顯示MEPE蛋白可促進牙髓細胞的體外礦化。
　　五、采用穩(wěn)態(tài)瓊脂糖凝