靶向VEGF的miR-126在結(jié)直腸癌侵襲和血管生成過程中的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　 腫瘤轉(zhuǎn)移播散一直是腫瘤治療研究中的一大難題。腫瘤細胞從原發(fā)灶脫離，侵入間質(zhì)，內(nèi)滲進入血管，隨血流到達遠處器官組織定植，繼續(xù)增殖成瘤，多器官受累加速患者死亡。單就結(jié)直腸癌而言，50％的癌灶會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌導(dǎo)致的患者死亡，90％是由于腫瘤的轉(zhuǎn)移播散引起。腫瘤血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵性事件，抑制腫瘤血管生成能顯著地抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。抗腫瘤血管生成是不同于常規(guī)抗腫瘤治療的新策略。
　　

2、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體調(diào)控途徑則是腫瘤血管形成的核心因素。在結(jié)直腸癌的發(fā)展過程中，VEGF的作用尤為突出。VEGF在結(jié)直腸癌組織中表達水平顯著高于癌旁正常粘膜，且表達水平與腫瘤大小顯著相關(guān)。高表達的VEGF不但促進腫瘤血管新生，而且與結(jié)直腸癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和Dukes分期呈正相關(guān)。VEGF受體家族廣泛表達于瘤細胞及間質(zhì)血管內(nèi)皮細胞，進一步說明VEGF及其受體信號通路促進結(jié)直腸癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。近年，針對VE

3、GF及其受體的靶向治療已經(jīng)成為抗腫瘤治療的重要策略。如人源化VEGF單抗bevacizumab，其聯(lián)合化療藥物常被用作治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的一線方案。另外還有可抑制VEGFR酪氨酸激酶的藥物sunitinib和sorafenib等。microRNA在人體組織中廣泛表達，對30％的編碼基因行使調(diào)節(jié)功能，對增殖、分化、死亡等基本細胞過程具有重要的調(diào)控作用。近期，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)有不同microRNA的異常表達，說明特異性的microRNA與腫

4、瘤發(fā)生有密切聯(lián)系。它們可能扮演致癌基因或者抑癌基因的角色，這取決于它們作用的靶基因。一些具有促癌或者抑癌作用的microRNA連同它們的靶基因已經(jīng)相繼被鑒定出來。例如，在結(jié)直腸癌中，miR-143的表達降低是KRAS持續(xù)激活并促進惡性轉(zhuǎn)化的重要原因;miR-135則可以抑制APC的表達，異常激活WNT通路。這可能是除APC基因突變以外存在的另一種APC失調(diào)的情況。
　　 作為明確的促癌因子，VEGF是microRNA的調(diào)控靶點。

5、miR-126可以通過抑制SPRED1、PIK3R2，解除二者對VEGF信號途徑的抑制，促進胚胎血管形成并維持管壁的完整性。VEGF可以增加miR-296的表達，靶向抑制HGS，解除其對PDGFR和VEGFR2的抑制，提高VEGF的作用效率，促進腫瘤血管生成，形成一個正反饋路徑。這些研究均提示，microRNA對以VEGF及其受體為中心的腫瘤血管生成過程具有重要的調(diào)控作用，調(diào)節(jié)某些特異性microRNA的表達可能成為抗VEGF治療的新手

6、段。
　　 我們在前期的生物信息學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)，VEGF是miR-126的預(yù)測靶基因。本研究希望通過體外實驗鑒定直腸癌中miR-126——VEGF這一靶向調(diào)控關(guān)系的存在，并進一步探討miR-126表達缺失的原因，及其對VEGF介導(dǎo)的結(jié)直腸癌腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移過程的調(diào)控機制。
　　 研究方法和結(jié)果:
　　 1.miR-126在結(jié)直腸癌中的表達異常降低
　　 采用Taqman探針熒光定量PCR法檢測了12對結(jié)直

7、腸癌組織以及6種結(jié)直腸癌細胞株中成熟miR-126的表達水平。結(jié)果顯示，腫瘤組織中的miR-126表達水平與其相應(yīng)的癌旁正常粘膜相比，均顯著下降。其在6種細胞系中的表達水平也顯著低于正常對照(P＜0.05)。
　　 2.恢復(fù)結(jié)直腸癌細胞中miR-126的表達水平能夠抑制VEGF的表達
　　 采用lipofectmin2000轉(zhuǎn)染miR-126的precusors進入LoVo和SW620細胞株，以恢復(fù)miR-126的表達。

8、Western blot結(jié)果顯示，與陰性對照相比，腫瘤細胞中miR-126表達水平恢復(fù)后，VEGF的表達受到了顯著抑制。但RT-PCR的結(jié)果中卻沒有發(fā)現(xiàn)VEGF的mRNA表達水平變化有統(tǒng)計學(xué)差異。提示這種抑制作用可能是在蛋白翻譯水平產(chǎn)生的。
　　 3.miR-126通過與VEGF mRNA3'UTR結(jié)合而直接調(diào)控VEGF表達
　　 生物信息學(xué)預(yù)測在VEGF mRNA3'UTR中含有一個可與miR-126互補結(jié)合的位點。我

9、們分別構(gòu)建了含有野生型和突變型結(jié)合位點序列的熒光素酶報告基因(VEGF3'UTR/ mut VEGF3'UTR)，將它們和miR-126的precursors或者scramble共轉(zhuǎn)染進入HEK293細胞中，檢測細胞的熒光素酶活性。共轉(zhuǎn)染miR-126 precursors/VEGF3'UTR的HEK293細胞，其熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-126 scramble/VEGF3'UTR的細胞，而共轉(zhuǎn)染miR-126 precurs

10、ors/mutVEGF3'UTR則可以抵消共轉(zhuǎn)染miR-126 precursors/VEGF3'UTR引起的熒光素酶活性降低。此結(jié)果說明，miR-126確實是通過與VEGF mRNA的3'UTR直接結(jié)合，從而遏制VEGF的蛋白翻譯過程。
　　 4.恢復(fù)miR-126表達可抑制結(jié)直腸癌細胞的遷移及侵襲能力，但不影響其增殖
　　 利用alarmar blue法檢測LoVo和SW620細胞恢復(fù)miR-126表達后細胞的增殖能

11、力變化。實驗分組為:未處理組(blank)、陰性對照組（scramble）和處理組(pre-miR-126)，每組分別檢測細胞轉(zhuǎn)染處理后24h、48h和72h三個時間點的細胞活性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染處理后的72h內(nèi)，不同處理組的LoVo或SW620細胞之間，其增殖能力均未出現(xiàn)差異變化(P＞0.05)。提示miR-126并不參與結(jié)直腸癌細胞的增殖調(diào)控。運用Transwell實驗，檢測結(jié)直腸癌細胞在miR-126表達水平恢復(fù)后，其細胞運動能力，

12、即遷移能力和侵襲能力的改變。處理分組同增值實驗，細胞轉(zhuǎn)染處理24h后，將細胞消化重懸加入Transwell裝置上室（侵襲試驗上室預(yù)鋪基質(zhì)膠Matrigel），下室為含20％FBS的新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，計數(shù)上室濾膜下表面的細胞數(shù)。結(jié)果顯示，恢復(fù)miR-126后的結(jié)直腸癌細胞，其遷移和侵襲能力相比未處理和陰性對照處理組均顯著減弱(P＜0.05)。
　　 5.恢復(fù)miR-126的表達能夠抑制結(jié)直腸癌細胞通過分泌VEGF誘導(dǎo)的腫瘤

13、血管形成
　　 轉(zhuǎn)染precusors恢復(fù)LoVo細胞中miR-126的表達水平，在轉(zhuǎn)染后48h取細胞培養(yǎng)基檢測其中VEGF的濃度。結(jié)果在10nM、30nM和30nM的轉(zhuǎn)染濃度下，LoVo細胞培養(yǎng)基中的VEGF濃度3.61±0.08 ng/ml、3.05±0.08 ng/ml和2.68±0.11 ng/nl均顯著低于未處理組(blank)的4.12±0.18 ng/ml和陰性對照組（scramble）的3.99±0.10 ng/

14、ml(P＜0.05)。內(nèi)皮細胞遷移實驗中，在transwell體系中將人微血管內(nèi)皮細胞（HMVEC）和經(jīng)過轉(zhuǎn)染處理的LoVo細胞共培養(yǎng)24h后，計數(shù)上室濾膜下表面的細胞數(shù)。結(jié)果顯示，與恢復(fù)了miR-126表達的LoVo細胞(pre-miR-126)共培養(yǎng)的HMVEC細胞，其遷移能力顯著低于與未處理組(blank)和陰性對照組(scramble) LoVo細胞共培養(yǎng)的HMVEC細胞(P＜0.05)。體外的小管形成實驗中，在LoVo細胞轉(zhuǎn)染

15、后的48h，收集未處理組(blank)、陰性處理組（scramble）和處理組（pre-miR-126）的細胞培養(yǎng)基，用以重懸HMVEC細胞，以0.5×104/well數(shù)量將HMVEC種入預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠的96孔板中。37℃孵育細胞12h，顯微鏡下計數(shù)HMVEC形成的完整封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，處理組培養(yǎng)基刺激HMVEC細胞形成小管的能力顯著地弱于未處理組和陰性處理組。進一步利用雞胚絨毛膜尿囊實驗?zāi)Ｐ驮u估m(xù)iR-126表達水

16、平對于體內(nèi)腫瘤血管生成能力的影響。以無菌明膠海面為載體，分別攜帶各組上述收集到的培養(yǎng)基，將載體置于雞胚絨毛尿囊膜血管稀疏部位，計算以載體為中心向四周放射狀生成的毛細血管數(shù)，以此評價血管新生能力。結(jié)果與體外實驗結(jié)果近似，處理組培養(yǎng)基(pre-miR-126)刺激雞胚血管新生的能力顯著弱于未處理組(blank)和陰性對照組(scramble)(P＜0.05)。
　　 6.啟動子甲基化是結(jié)直腸癌中miR-126的表達缺失的重要原因

17、r>　　 采用MSP方法檢測結(jié)直腸癌組織中miR-126啟動子區(qū)的甲基化修飾情況。被檢測的62例結(jié)直腸癌組織中，有50例在miR-126啟動子區(qū)有甲基化修飾存在。而對6種結(jié)直腸癌細胞株的MSP檢測結(jié)果則顯示，6種細胞株均受不同程度的甲基化修飾。進一步的BSP測序結(jié)果與MSP結(jié)果符合，各細胞株miR-126啟動子區(qū)CpG島內(nèi)的CG二核苷酸均有較高頻率地甲基化修飾。使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-CdR處理六種細胞株，使其啟動子區(qū)去甲基化

18、后收集細胞，利用real time-PCR檢測miR-126的表達情況，并用western blot檢測VEGF的表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)去甲基化處理后，各細胞株中miR-126的表達水平均有顯著提高，而隨著miR-126表達的上調(diào)，VEGF的表達也受到相應(yīng)抑制。提示啟動子區(qū)的甲基化是使得結(jié)直腸癌中miR-126表達異常降低甚至缺失的重要原因，并且是結(jié)直腸癌中VEGF表達異常增高的原因之一。
　　 結(jié)論:
　　 本研究證實