發(fā)形霞水母(Cyanea capillata)觸手cDNA文庫與蛋白組研究.pdf

1、水母屬刺胞動(dòng)物門，是一類分布廣泛、生物總量較大的海洋浮游動(dòng)物。近年來隨著人類活動(dòng)對(duì)海洋環(huán)境的影響，水母爆發(fā)與蜇傷事件頻發(fā)，日漸引起科研人員的關(guān)注。水母研究大略可分兩方面，其一是控其害，主要針對(duì)水母爆發(fā)原因及蜇傷防治進(jìn)行研究;其二是用其利，主要針對(duì)水母中富含的肽類生物活性物質(zhì)及功能基因進(jìn)行開發(fā)利用。然而由于水母活性物質(zhì)種類復(fù)雜、一些組分表達(dá)豐度低等原因，上述兩方面的研究均受到一定制約，亟待解決。
　　 本文以我國東南沿海常見大型有

2、毒水母——發(fā)形霞水母（Cyanea capillata）觸手為研究對(duì)象，進(jìn)行cDNA文庫及蛋白質(zhì)組研究。通過對(duì)C.capillata觸手組織的核酸和蛋白質(zhì)的全譜鑒定，初步明確水母觸手的核酸與蛋白分子組成及相互關(guān)系，通過分析可能與水母毒器——刺胞發(fā)射過程相關(guān)的分子及信號(hào)通路，闡述水母捕食、防御等生命活動(dòng)的微觀過程，為水母蜇傷防治研究提供理論基礎(chǔ);同時(shí)通過篩選一系列水母特有的活性分子，以備后續(xù)開發(fā)利用。
　　 方法:
　　

3、第一部分:首先，采用CLONTECH SMART(Primer Extension)技術(shù)構(gòu)建C.capillata觸手組織全長cDNA文庫，并對(duì)cDNA文庫全部序列進(jìn)行同源搜索鑒定、GO注釋和Pathway分析。其次以前期初步分離純化、質(zhì)譜鑒定的C.capillata觸手活性蛋白序列為依據(jù)，利用兩兩比對(duì)方法在已構(gòu)建的cDNA文庫中釣取活性蛋白對(duì)應(yīng)基因，一方面利用生物信息學(xué)方法對(duì)該活性蛋白基因進(jìn)行序列鑒定，基本性質(zhì)和初、高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，

4、另一方面利用基因重組技術(shù)對(duì)該活性蛋白基因進(jìn)行重組表達(dá)。
　　 第二部分:利用SDS-PAGE策略構(gòu)建C.capillata觸手組織蛋白質(zhì)組，以水螅Hydratxid6083數(shù)據(jù)庫和本教研室已構(gòu)建觸手de novo轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為參考，對(duì)C.capillata觸手組織的所有蛋白進(jìn)行鑒定;而后進(jìn)行GO注釋、COG注釋及Pathway分析，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)注釋信息進(jìn)行解讀。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:首先，成功構(gòu)建C.

5、capillata觸手組織cDNA文庫。文庫庫容量1.92×106，重組率98.18％，序列完整性比率100％，插入序列長度平均為651bp，有效序列1035條，可被聚類成528個(gè)Unigene。通過多種生物信息學(xué)方法分析，篩選得到一些具有特殊生理功能或活性的蛋白分子，如多種酶類、酶抑制劑、抗氧化蛋白等。其次成功從已構(gòu)建C.capillata觸手cDNA文庫中篩選得到前期純化所得活性蛋白的基因序列，生物信息學(xué)分析表明該基因全長約820b

6、p，編碼一個(gè)含198個(gè)氨基酸殘基，分子量約22.49 kDa，等電點(diǎn)5.17的蛋白，注釋結(jié)果顯示其可能為水母Rho-GDI(Rho guaninenucleotide dissociation inhibitor)蛋白，是調(diào)控Rho蛋白活性的重要信號(hào)分子。目前通過基因重組技術(shù)已成功構(gòu)建水母Rho-GDI基因重組子，并成功誘導(dǎo)表達(dá)和純化，活性檢驗(yàn)結(jié)果表明該重組蛋白雖無致死毒性，但可使斑馬魚呼吸加快、平衡失調(diào)、行動(dòng)遲緩。
　　 第二

7、部分:成功構(gòu)建C.capillata觸手組織蛋白質(zhì)組，全庫鑒定得到6531條肽段，對(duì)應(yīng)2360個(gè)蛋白分子。鑒定所得蛋白分子量和等電點(diǎn)分布較廣(MW3.14 kDa-1132.7kDa，pI3.24-13.86)，分子量主要集中于200kDa以內(nèi)，等電點(diǎn)主要集中于4-12間，其中90％為親水蛋白，10％為疏水蛋白。對(duì)鑒定所得2360條蛋白進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示2360條序列中有1796(76.1％)條可被注釋到53個(gè)GO分類中，1908

8、(80.8％)條序列被定位到250條不同Pathway中1686(71.4％)條序列被COG注釋到23個(gè)分類中，1974條序列中共存在1096個(gè)蛋白超家族的2128個(gè)Domain。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn):1、C.capillata中存在Wnt、Notch、TGF-β等多條與刺胞動(dòng)物發(fā)育相關(guān)的通路;2、C.capillata觸手中存在能破壞細(xì)胞基質(zhì)的物質(zhì)和潛在神經(jīng)毒素，如絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶類、C型凝集素樣蛋白、解聚素、磷脂酶A2等。同時(shí)發(fā)現(xiàn)與刺

9、絲囊結(jié)構(gòu)及發(fā)射調(diào)控相關(guān)的分子及通路，如:Ca2+信號(hào)通路、神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)分子及通路等;3、C.capillata中存在多種蛋白酶抑制劑，如絲氨酸蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、半胱氨酸抑制劑等。
　　 結(jié)論:
　　 1、C.capillata觸手cDNA文庫構(gòu)建成功，篩選得到一系列具有開發(fā)利用前景的活性蛋白基因，如:絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶類、絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、超氧化物歧化酶、硒蛋白等。為C.cap

10、illata基因資源的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。
　　 2、成功從已構(gòu)建C.capillata觸手cDNA文庫釣取前期純化所得活性蛋白基因，并重組表達(dá)。形成生物大分子序列生物信息學(xué)分析流程并實(shí)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)室蛋白純化平臺(tái)與分子重組表達(dá)平臺(tái)的對(duì)接，有利于今后對(duì)cDNA文庫的挖掘利用。
　　 3、成功構(gòu)建C.capillata觸手蛋白組，經(jīng)鑒定分析，首先，得到與刺胞動(dòng)物發(fā)育相關(guān)的通路，為水母進(jìn)化發(fā)育的分子機(jī)理研究提供更多的信息;其次，得