一種發(fā)形霞水母來(lái)源多肽生長(zhǎng)因子的生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的：
　　本課題組致力于發(fā)形霞水母（Cyanea capillata，C.capillata）來(lái)源的活性物質(zhì)及相關(guān)機(jī)理研究多年。以往研究中，我們發(fā)現(xiàn)水母觸手表現(xiàn)出超強(qiáng)創(chuàng)傷修復(fù)能力，且觸手中刺細(xì)胞具有快速增殖的特點(diǎn)，提示水母觸手中可能存在高活性促生長(zhǎng)因子。在分析C.capillata觸手提取物(tentacle extract，TE)的細(xì)胞活性時(shí)也觀察到一個(gè)有趣現(xiàn)象，即低濃度的TE可以誘發(fā)細(xì)胞增殖。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測(cè)TE中

2、含有類(lèi)似促增殖活性物質(zhì)。
　　本課題組前期建立了C.capillata觸手組織cDNA文庫(kù)，分析發(fā)現(xiàn)其中有四條血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)類(lèi)似序列，為我們從TE中提取促生長(zhǎng)活性物質(zhì)提供了重要理論依據(jù)。組合應(yīng)用多種分離技術(shù)，我們成功從TE中分離得到具有促生長(zhǎng)活性的一個(gè)顆粒蛋白樣多肽生長(zhǎng)因子并命名為CcGRN-1(Cyanea capillata granulin-

3、1,CcGRN-1)。
　　因此，本課題將重點(diǎn)研究TE和CcGRN-1的促生長(zhǎng)活性及其作用機(jī)制。通過(guò)本課題的研究，我們希望可以為將來(lái)某些特殊疾病或環(huán)境造成的傷口難愈合情況提供新的治療思路。
　　方法：
　　第一部分 TE的生物學(xué)活性研究
　　首先，采用CCK-8法檢測(cè)TE對(duì)HUVECs細(xì)胞活力的影響。然后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TE對(duì)HUVECs細(xì)胞周期進(jìn)程的影響;并檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinB1和Cycl

4、inD1表達(dá)的影響。隨后，采用Western Blotting檢測(cè)TE對(duì)HUEVCs中生長(zhǎng)相關(guān)信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)情況，包括PI3K/Akt，ERK1/2 MAPK，JNKMAPK，p38MAPK和NF-κB通路以及下游caspase-3，8，9和CytoC蛋白的表達(dá)水平;同時(shí)，采用免疫熒光技術(shù)對(duì)信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)情況進(jìn)一步驗(yàn)證。隨后，選擇TE激活的信號(hào)通路對(duì)應(yīng)的抑制劑，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響。最后，采用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TE對(duì)細(xì)胞遷移能力

5、的影響。
　　第二部分 CcGRN-1的生物學(xué)活性研究
　　首先，采用CCK-8法檢測(cè)CcGRN-1對(duì)HUVECs的細(xì)胞活力的影響。其次，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CcGRN-1對(duì)HUVECs細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，并檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinB1和CyclinD1的表達(dá)變化情況。然后，采用Western Blotting檢測(cè)CcGRN-1對(duì)HUEVCs中生長(zhǎng)相關(guān)信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)情況，主要包括PI3K/Akt，ERK1/2 MAPK

6、，JNK MAPK和NF-κB通路;同時(shí)，采用免疫熒光技術(shù)對(duì)信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)情況做進(jìn)一步的驗(yàn)證。隨后，選擇CcGRN-1激活的信號(hào)通路對(duì)應(yīng)的抑制劑，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響。最后，采用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CcGRN-1的促細(xì)胞遷移能力。
　　同時(shí)，選取商品化血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF作為對(duì)照，并行分析其與CcGRN-1的生物學(xué)活性及作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　第一部分 TE的生物學(xué)活性研究
　　CCK-8法檢測(cè)結(jié)果

7、顯示，高劑量TE抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，使HUVECs細(xì)胞活力呈劑量依賴(lài)性降低;而低劑量TE可以促進(jìn)細(xì)胞活力明顯升高。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，TE可以促進(jìn)細(xì)胞從G1期過(guò)渡到細(xì)胞分裂活躍期（S和G2期），加快細(xì)胞周期進(jìn)程;TE還可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)明顯增加。
　　在信號(hào)通路方面，TE可以激活HUVECs中PI3K/Akt，ERK1/2 MAPK以及JNKMAPK通路，而對(duì)p38 MAPK和NF-κB通路以及下游信號(hào)通路中包括caspa

8、se-3，8，9以及CytoC蛋白表達(dá)沒(méi)有影響;免疫熒光檢測(cè)結(jié)果證實(shí)TE確實(shí)可以激活PI3K/Akt，ERK11/2MAPK以及JNK MAPK通路。信號(hào)通路干預(yù)結(jié)果顯示PD98059可以抑制CyclinB1和CyclinD1的表達(dá)，而LY294002和SP600125對(duì)其沒(méi)有影響，說(shuō)明TE主要是通過(guò)激活ERK1/2 MAPK通路上調(diào)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的。最后，細(xì)胞劃痕修復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明，TE可以誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生細(xì)胞遷移。
　　第

9、二部分 CcGRN-1的生物學(xué)活性研究
　　CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，CcGRN-1和VEGF均對(duì)HUVECs活力具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性促進(jìn)作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，兩者均可以促進(jìn)細(xì)胞從G1期過(guò)渡到細(xì)胞分裂活躍期（S和G2期），加快細(xì)胞周期進(jìn)程;此外，兩者還可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)增加。
　　在信號(hào)通路激活方面，Western Blotting結(jié)果顯示CcGRN-1和VEGF均可以激活PI3K/Akt和ERK1/2MAPK通路

10、，而對(duì)JNK MAPK和NF-κB通路沒(méi)有影響;免疫熒光檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了CcGRN-1和VEGF確實(shí)可以激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路。信號(hào)通路干預(yù)結(jié)果顯示PD98059可以抑制CyclinB1和CyclinD1的表達(dá)，而LY294002沒(méi)有影響，說(shuō)明CcGRN-1主要是通過(guò)激活ERK1/2 MAPK通路上調(diào)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的。最后，細(xì)胞劃痕修復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明，CcGRN-1和VEGF均可以誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生細(xì)胞遷移。<

11、br>　　結(jié)論：
　　低濃度TE可以提高細(xì)胞活力，加快細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，提示TE具有促細(xì)胞增殖效應(yīng);在作用機(jī)制方面，TE可以磷酸化激活PI3K/Akt，ERK1/2 MAPK和JNK MAPK通路，而其中的ERK1/2 MAPK通路與細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)增加密切相關(guān)，提示其可能與促細(xì)胞增殖有關(guān);最后，細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明TE可以誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。
　　另一方面，CcGRN-1具有與VEGF類(lèi)似的細(xì)胞活力效應(yīng)，可

12、以加快細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，表明CcGRN-1具有與VEGF類(lèi)似的促細(xì)胞增殖效應(yīng);在作用機(jī)制方面，CcGRN-1也與VEGF類(lèi)似，主要激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路，而其中的ERK1/2 MAPK通路與細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)增加密切相關(guān);最后，通過(guò)細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明CcGRN-1與VEGF均可以誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。基于CcGRN-1和VEGF在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面具有很大的共性，我們認(rèn)為CcGRN-1作為一種海洋生