發(fā)形霞水母觸手提取物的分離純化及其活性研究.pdf

1、隨著氣候變暖和近海的富營養(yǎng)化，全球海洋，包括我國近海水母爆發(fā)日益頻繁[1]。有毒水母傷人事件逐年上升，水母蜇傷成為最常見的海洋生物傷[2]。研究表明，水母毒素是一類結構新穎的肽類毒素，相對分子質量從10～600kDa不等。水母毒素的生物活性廣泛，包括心血管毒性、溶血毒性、神經(jīng)肌肉毒性與皮膚毒性等[3]，其中心血管毒性是水母蜇傷致死的主要原因。
　　 近年來有很多關于水母毒素心血管毒性研究的報道，但大多數(shù)仍以粗毒為研究對象。目前尚

2、無水母心血管毒性蛋白成功純化與鑒定的報道，這與水母毒素本身的特性有關。由于水母毒素不穩(wěn)定，易分解[4]，在純化過程中活性喪失明顯，嚴重阻礙了其分離純化和作用機理的研究。水母毒素心血管毒性蛋白的分離純化已經(jīng)成為水母毒素研究的主要難點之一。
　　 本論文以我國東海采集的代表性有毒水母——發(fā)形霞水母(Cyanea capillata, C. Capillata)為研究對象，第一步研究水母觸手提取物和刺絲囊毒素的制備方法，獲取合適的用于

3、心血管毒性蛋白分離純化的粗毒樣品；第二步通過測定所選樣品的毒性變化，確定在純化階段各組分活性監(jiān)測時的合適劑量，并分析常用緩沖液對純化樣品活性的影響，優(yōu)化純化過程中最佳緩沖液的選擇。第三步先用鹽析、超濾等方式預處理TOE，再綜合利用離子交換層析、凝膠過濾層析等色譜等方法進行分離純化，利用心血管毒性檢測模型監(jiān)測各組分活性，聚丙烯凝膠電泳檢測活性組分中的蛋白成分；最后，利用基質輔助激光解析飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）技術完成對分離

4、到的活性蛋白一級結構的測定，并對它們的序列特點及生物活性進行分析。
　　 方法：
　　 第一部分：觸手提取物和刺絲囊毒素的制備
　　 經(jīng)過自溶、過濾、離心等步驟制備C. Capillata的觸手提取物(tentacle-only extract, TOE)和刺絲囊(nematocyst)。觀察不同自溶時間對觸手的自溶率和刺絲囊獲得量的影響。通過光學顯微鏡觀察C. Capillata刺絲囊的形態(tài)特點并進行分析。比較

5、反復凍融、玻璃勻漿、組織破碎儀破碎等方式破碎刺絲囊囊壁制備刺絲囊毒素（Nematocyst venom, NV）的效果。測定并比較TOE和NV兩者心血管毒性和溶血活性，并通過SDS-PAGE比較兩者蛋白成分差異。綜合評定后確定用于后續(xù)分離純化的粗毒樣品。
　　 第二部分：觸手提取物的毒性研究
　　 改良寇氏法測定TOE對昆明種小鼠尾靜脈注射的LD50：取昆明種小鼠108只，雌雄各半，隨機分成9組，每組12只，禁食12 h

6、后按0.1ml/10g體重尾靜脈注射TOE，連續(xù)7 d密切觀察并記錄小鼠的攝食、行為、排泄物、中毒/死亡情況。Sprague-Dawley (SD)大鼠頸外靜脈插管給藥，股動脈插管監(jiān)測血壓變化分析不同濃度的TOE心血管毒性，完成TOE對SD大鼠致死臨界值Dt的初步測定，為后續(xù)純化組分活性測定提供給藥劑量參考。并將TOE浸沒在常用的幾種陰陽離子交換緩沖液過夜透析，測定其對大鼠心肌細胞的致死毒性。
　　 第三部分：TOE的分離純化及

7、鑒定
　　 先用硫酸銨沉淀和超濾的方式預處理TOE，除去大量的雜蛋白，得出可能的目標蛋白的分子量范圍，然后以BioLogic DuoFlow (Bio-Rad公司)和?KTA Purifier（GE Healthcare）蛋白純化系統(tǒng)為主要技術平臺，綜合利用凝膠過濾、離子交換層析等多種方法，分離純化C. Capillata TOE粗毒。SD大鼠頸外靜脈插管給藥、股動脈插管監(jiān)測血壓變化來分析各組分心血管毒性，SDS-PAGE分析各

8、組分蛋白成分，進一步指導心血管毒性組分的分離純化。得到目標蛋白的單一條帶后利用基質輔助激光解析飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）技術完成對其一級結構的測定，并對它們的序列特點及可能存在的生物活性進行初步分析。
　　 結果：
　　 第一部分：觸手提取物和刺絲囊毒素的制備
　　 通過自溶、過濾、離心等方式能成功分離得到C. Capillata的觸手提取物和刺絲囊。水母觸手不同的自溶時間會影響觸手的溶解率。在觸手

9、自溶實驗中，0h組是以超聲破碎的方式幫助觸手自溶，2 h組玻璃棒不間斷攪拌，所以這兩組未溶解的觸手的量較4～48 h組要少一些，同樣得到的刺絲囊的量要多一些。48 h、96 h (m/v, 1:1)、96 h (m/v, 1:2)以及96 h (m/v, 1:3)幾組未溶的觸手較少。在96 h (m/v, 1:1)獲得的刺絲囊質量最多。綜上所述，發(fā)形霞水母觸手自溶的最佳條件為：在觸手質量與無菌海水體積比為1:1的環(huán)境中自溶96 h。刺絲

10、囊的顯微鏡觀察結果顯示刺絲囊包含兩個部分：刺絲囊囊腔和內部的刺絲。C. Capillata刺絲囊從形狀上可分為香蕉形和橢圓形，以香蕉形為主。在提取NV過程中，反復凍融對刺絲囊囊壁的破壞較小，而采用玻璃勻漿器勻漿的方式能有效破碎大部分刺絲囊，獲得NV。TOE和NV兩者均具有較強的溶血活性，溶血活性劑量曲線呈“S”形。在心血管毒性方面，相同劑量的TOE的活性要明顯強于NV。TOE和NV的電泳結果顯示，TOE蛋白條帶比NV的蛋白條帶多且明顯。

11、
　　 第二部分：觸手提取物的毒性研究
　　 測得TOE對昆明種小鼠尾靜脈注射的LD50劑量為4.244 mg/kg，95％的可信限為3.679 mg/kg-4.862 mg/kg，小鼠的癥狀呈現(xiàn)劑量依耐性。低劑量組（<5 mg/kg）小鼠表現(xiàn)為精神萎靡、四肢乏力、行動遲緩、蜷縮等癥狀，部分小鼠于48 h內死亡，死亡動物解剖，肉眼觀察小鼠的肺呈鮮紅色，有水腫、淤血等癥狀；心臟略腫大。超過48 h未死亡者逐漸恢復至正常狀態(tài)

12、，連續(xù)觀察7 d，小鼠攝食、活動和大小便均正常，無特殊分泌物，處死動物解剖肉眼觀察，主要臟器未見異常。中劑量組（5～10mg/kg）小鼠表現(xiàn)為精神萎靡、四肢乏力、行動遲緩，部分出現(xiàn)肌顫、蜷縮等癥狀，早期還伴隨著呼吸加深、加快表現(xiàn)，隨著時間延長逐漸減弱，最后出現(xiàn)陳-施式呼吸而死亡，死亡時間大約在2 h左右。死亡動物解剖，肉眼觀察肺出現(xiàn)水腫、淤血等癥狀，心臟基本正常。高劑量組（>10mg/kg）小鼠迅速出現(xiàn)呼吸加深、加快表現(xiàn)，1min左右逐

13、步出現(xiàn)全身性肌顫、雙下肢抽搐、全身性驚厥、角弓反張等中樞神經(jīng)系統(tǒng)典型癥狀。小鼠大多在5 min內死亡，死亡時伴有大小便失禁。死亡動物解剖，肉眼觀察肺和心臟基本正常。
　　 TOE對SD大鼠致死估計臨界值Dt約為0.8 mg/kg。靜脈注射TOE后30s內會迅速產(chǎn)生一個輕微而短暫的升血壓反應，而后伴隨著劇烈的血壓下降。0.7 mg/kg劑量組的大鼠在1min至2 min期間血壓下降最明顯，5 min左右血壓達到最低值（約40mmH

14、g）。隨著時間的推移，血壓逐漸恢復，30min后基本穩(wěn)定，可恢復至80mmHg左右。0.8 mg/kg劑量組的大鼠在0.5 min至2 min期間血壓下降明顯，2 min后血壓繼續(xù)下降，持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)部分大鼠血壓會逐漸的恢復至70mmHg左右，另有部分大鼠則在20min左右死亡。0.9 mg/kg劑量組的大鼠1min至2 min期間血壓下降明顯，伴隨著劇烈的抽搐，血壓持續(xù)下降，20min至40min期間陸續(xù)死亡。以此估計，TOE對SD大鼠

15、致死估計臨界值Dt約為0.8 mg/kg。
　　 第三部分：TOE的分離純化及鑒定
　　 使用硫酸銨沉淀法和超濾法處理C. Capillata TOE，初步鎖定一27 kDa的蛋白為可能的心血管毒性組分。再通過陰陽離子交換色譜柱及凝膠過濾色譜柱進一步對毒素進行分離純化，最終確定27 kDa的條帶蛋白是C. Capillata TOE中存在的心血管毒性蛋白，并利用MALDI-TOF質譜技術解析27 kDa條帶蛋白的一級結構

16、。
　　 結 論
　　 C. Capillata TOE具有與NV相當或略強于NV的心血管毒性。相比較而言，TOE的制備較NV的制備操作簡單，且可獲得的樣品量大，是分離純化心血管毒性蛋白的合適樣品。
　　 TOE具有很強的毒性，對昆明種小鼠尾靜脈注射的半數(shù)致死劑量（LD50）為4.244 mg/kg，對SD大鼠的致死估計臨界值Dt值約為0.8 mg/kg。
　　 采用鹽析、超濾以及離子交換等方法純化TOE