斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的蛋白組研究.pdf

1、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種之一，在世界上同樣占有重要的地位,在有關(guān)斑節(jié)對蝦的研究上，性腺發(fā)育調(diào)控的研究受到了眾多學(xué)者的關(guān)注。同時，繼基因組學(xué)之后蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為了分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，蛋白組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到養(yǎng)殖生物的分子生物學(xué)研究中。目前，有關(guān)斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的蛋白質(zhì)組學(xué)研究仍較少，斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制不明確。所以本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)方法對斑節(jié)對蝦不同發(fā)育時

2、期卵巢進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步探明斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供更多的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　本研究以斑節(jié)對蝦不同發(fā)育時期卵巢為研究對象，采用雙向電泳技術(shù)對卵巢發(fā)育表達(dá)蛋白進(jìn)行分離并篩選出差異表達(dá)蛋白點(diǎn)；然后對篩選得到的差異點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜結(jié)果結(jié)合實(shí)驗(yàn)室已開展的斑節(jié)對蝦肝胰腺轉(zhuǎn)錄組篩選相關(guān)基因進(jìn)行克隆表達(dá)；同時從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出與卵巢發(fā)育相關(guān)的泛素融合蛋白基因片段PmUbS27、PmUbL40，進(jìn)行了克隆和在卵巢不同發(fā)育時期的表

3、達(dá)分析，相關(guān)結(jié)果如下：
　?。?）構(gòu)建了適合于斑節(jié)對蝦卵巢組織蛋白的雙向電泳技術(shù)體系，得到了分辨率高、重復(fù)性好的斑節(jié)對蝦發(fā)育Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時期卵巢組織蛋白表達(dá)圖譜。
　?。?）通過斑節(jié)對蝦卵巢組織蛋白表達(dá)圖譜研究了卵巢發(fā)育Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，結(jié)果顯示卵巢發(fā)育Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期蛋白質(zhì)分別獲得了4147、4125、3972個蛋白點(diǎn)，其中Ⅱ、Ⅲ期表達(dá)差異蛋白點(diǎn)418個，Ⅲ、Ⅳ期表達(dá)差異蛋白點(diǎn)460個。其中Ⅱ期到Ⅲ期相比有159個蛋

4、白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，259個蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào);Ⅲ期到Ⅳ期相比有181個蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，279個蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。同時在三個時期中共同表達(dá)且表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的蛋白點(diǎn)分別有19、146個，從中選取了18個表達(dá)量差異2倍及以上的蛋白點(diǎn)，成功鑒定出12種蛋白，其中上調(diào)蛋白有卵黃蛋白原、β-肌動蛋白，表達(dá)下調(diào)的蛋白有血藍(lán)蛋白、吡咯啉-5-羧酸還原酶（delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase，mitochond

5、rial，PmP5CDh）、原肌球蛋白、前列腺素還原酶1、白介素結(jié)合增強(qiáng)因子3同系物x4亞型、肌動蛋白1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白57、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferases,PmGST）、β-微管蛋白、延長因子1-α。
　　(3)根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，從鑒定的12種蛋白中篩選了線粒體吡咯啉-5-羧酸還原酶（PmP5CDh）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（PmGST）進(jìn)行了研究，從mRNA水平檢測了PmP5CDh和PmGST在斑

6、節(jié)對蝦不同組織中和卵巢發(fā)育各時期的表達(dá)水平，結(jié)果顯示 PmP5CDh基因在斑節(jié)對蝦肌肉組織中表達(dá)量最高，其次為腦神經(jīng)，在其他各組織中表達(dá)無顯著性差異。PmGST基因在斑節(jié)對蝦精巢和血淋巴中表達(dá)量最高，其次為胸腹神經(jīng)、肝胰腺和卵巢。在斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育各時期的表達(dá)中，PmP5CDh基因呈現(xiàn)先升高后趨于平穩(wěn)，在卵巢發(fā)育Ⅲ期表達(dá)量達(dá)到最高。PmGST基因在卵巢發(fā)育過程中呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，但在Ⅳ期表達(dá)異常，表達(dá)量最小，在Ⅴ期達(dá)到最大值。

7、　?。?）泛素融合蛋白PmUbS27、PmUbL40基因cDNA序列全長分別為506bp、571bp，分別編碼154個、129個氨基酸的蛋白；在各組織中均有表達(dá)。兩個泛素核糖體蛋白是由氮末端的泛素結(jié)構(gòu)域和碳末端的核糖體蛋白結(jié)構(gòu)域組成。實(shí)時定量結(jié)果顯示，PmUbS27基因在卵巢中表達(dá)量顯著高于其他組織，并且在卵巢發(fā)育Ⅱ期表達(dá)量最高。PmUbL40基因在肝胰腺中表達(dá)量最高，其次為肌肉和卵巢，且在卵巢發(fā)育Ⅱ期表達(dá)量最高。
　　通過對上述