斑節(jié)對蝦幾種激素和基因與卵巢發(fā)育相關性的研究.pdf

1、由于目前普遍采用的剪眼柄催熟法存在很多弊端,對斑節(jié)對蝦繁育機理進行研究以尋找新的安全便利的催熟方法成為突破斑節(jié)對蝦雌性性腺難以大批量集中成熟問題的研究重點和難點。本研究確定了實驗用斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育所處時期,檢測了卵巢發(fā)育過程中血淋巴的四種激素的濃度變化,同時,克隆了與 M期相關的MPP6基因,研究了 MPP6基因表達情況及其與卵巢發(fā)育調(diào)控相關基因 cyclinB以及 cdc25的表達差異和相關性,為進一步研究與卵巢發(fā)育相關的激素和基因間

2、的關聯(lián)網(wǎng)絡奠定基礎,為研究斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育調(diào)控機理提供參考資料。
　　本實驗采用石蠟切片和HE染色技術,結(jié)合解剖學、細胞學和組織學技術對斑節(jié)對蝦卵巢各分期進行分類和鑒定,確定了實驗用斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育所處時期。主要鑒定依據(jù)為卵母細胞特征,即Ⅰ期卵巢中絕大多數(shù)細胞為卵原細胞,細胞小且細胞核比較大。Ⅱ期中大多數(shù)卵母細胞是染色質(zhì)核仁期卵母細胞和周邊核仁期卵母細胞。Ⅲ期中已出現(xiàn)少量的卵黃囊卵母細胞。Ⅳ期中大多數(shù)卵母細胞是卵黃囊卵母細胞。Ⅴ期

3、中可見成熟的邊緣布滿皮質(zhì)桿狀體的卵母細胞。Ⅵ期中多數(shù)卵母細胞是染色質(zhì)核仁期卵母細胞和周邊核仁期卵母細胞及部分皮質(zhì)桿狀體的卵母細胞。
　　采用化學發(fā)光法(Chemiluminesence immunoassay，CLIA)檢測了卵巢發(fā)育階段(Ⅱ期至Ⅵ期)血淋巴中促黃體生成激素(Luteinizing hormone，LH)、促卵泡生成激素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、孕酮(Progestero

4、ne，P)和雌二醇(Estradiol，E2)的濃度和變化趨勢。實驗結(jié)果顯示,卵巢發(fā)育過程中斑節(jié)對蝦血淋巴中促黃體生成激素在卵黃積累階段Ⅱ期至Ⅳ期濃度較高,Ⅱ期約為0.27 mIU/ml和Ⅳ期約為0.24 mIU/ml。卵巢成熟期Ⅴ期濃度最低約為0.10 mIU/ml,而后在恢復期濃度增大。促卵泡生成激素的濃度在卵巢發(fā)育起始期Ⅱ期達到峰值(約0.13 IU/ml),而后在卵巢發(fā)育過程中濃度持續(xù)下降,至卵巢成熟期Ⅴ期濃度最低(約為0.03

5、 IU/ml),而后在恢復期濃度增加。孕酮濃度在卵巢發(fā)育Ⅱ期緩慢升高,至Ⅵ期增長為105.3 pg/ml。雌二醇濃度在卵巢發(fā)育期中濃度大致相同,最大值Ⅲ期(77.0 pg/ml)為最小值Ⅳ期(68.7 pg/ml)的1.2倍。斑節(jié)對蝦血淋巴中 E2濃度自Ⅱ期卵巢開始發(fā)育起一直維持在較高水平,且呈高低交替變化趨勢。結(jié)果顯示斑節(jié)對蝦四種激素與卵巢發(fā)育有關,與其在脊椎動物中的功能一致可能發(fā)揮著促進卵巢發(fā)育的作用。
　　采用cDNA末端快

6、速擴增技術(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)從斑節(jié)對蝦總 RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中獲得了堿基長度為690bp的M期磷酸蛋白6(M-phase phosphoprotein6，MPP6)的全長 cDNA序列,并命名為 PmMPP6。該序列包含68 bp的5’非編碼區(qū)(UTR)和172 bp的3’非編碼區(qū)以及450bp的開放閱讀框(ORF),可編碼149個氨基酸。預測分子量為17.01kDa,理論等電點

7、為4.89。序列比對分析表明 PmMPP6與致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)的相似性和同源性最高。位點分析顯示 PmMPP6無糖基化位點,但是含有六個磷酸化位點,分別為5個 Ser位點,1個 Thr位點,沒有Tyr位點。系統(tǒng)樹分析顯示 PmMPP6歸屬于無脊椎動物大類。
　　采用實時熒光定量 PCR技術(Quantitative real time PCR，QRT-PCR)對三種基因進行表達檢測的結(jié)果可知,

8、cyclinB的mRNA在所檢測的卵巢、淋巴、腦、血、肌肉、心、鰓、肝胰腺和腸9種組織中均有不同程度的表達,在卵巢內(nèi)的表達量最高,淋巴次之,而在肝胰腺中的表達量最低。經(jīng)單因子方差分析,斑節(jié)對蝦 cyclinB基因 mRNA表達在卵巢中與其他組織存在極顯著性差異(P<0.01)。cyclinB的mRNA在卵巢發(fā)育二至六期中的表達量大致相同,無顯著性差異(P>0.05)。cdc25基因 mRNA在所測的9種組織中均有不同程度的表達,在心臟中

9、的表達量最高,肌肉次之,而在鰓中的表達量最低。經(jīng)單因子方差分析,斑節(jié)對蝦 cdc25基因mRNA在組織表達中存在顯著差異(P<0.05)。斑節(jié)對蝦 cdc25基因的mRNA在Ⅱ期卵巢表達量最高,Ⅲ期和Ⅳ期的表達量最低。在Ⅱ期卵巢中，mRNA相對表達量是在Ⅲ期中的1.6倍。經(jīng)單因子方差分析,斑節(jié)對蝦 cdc25 mRNA在卵巢發(fā)育期中的表達存在顯著性差異(P?0.05)。PmMPP6的mRNA在卵巢、淋巴、腦、血、肌肉、心、鰓、肝胰腺和腸