水稻根cDNA文庫中抗菌蛋白-肽編碼基因的篩選研究.pdf

1、作為防御系統(tǒng)的一部分，生物(包括植物)產(chǎn)生各種化合物來防御病原物的入侵。這些化合物包括蛋白和肽。鑒別并了解這些化合物及其在防御反應中的作用將可以更好的研究生物抗病的機理。 然而，目前發(fā)現(xiàn)這些肽和蛋白及其編碼基因的方法非常繁瑣，包括蛋白提取、純化、生物實驗和基因克隆等，從而限制了新的編碼抗菌肽/蛋白(AMP)的基因發(fā)現(xiàn)。 本研究以微孔濾膜為支持介質(zhì)，以菌體染色為鑒別手段，從cDNA文庫中篩選可能編碼抗菌肽的基因，克隆基因后

2、進行蛋白質(zhì)的體外表達，進而開展抗菌活性的鑒定。從水稻根cDNA表達文庫的約3×104個克隆出發(fā)，初篩得到了300多個候選克隆，進一步經(jīng)過固體涂板驗證、液體抑菌活性測定，確定其中57個為進一步驗證的陽性克隆。將這些陽性克隆提取質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株XL1-Blue、DH5ct、BL21(DE3)pLysS、ER2566中進行抗菌活性鑒定，根據(jù)對不同細菌菌株的抗性，可將這些克隆分為四類：第1類是四種菌中染色都為藍色的克??；第1I類是三

3、種菌中染色為藍色的克隆，依此類推。對陽性克隆進行5’端測序，然后進行BlastX分析，結(jié)果表明有些序列編碼已知的抗菌肽，如脂轉(zhuǎn)移蛋白；有些序列編碼抗性相關蛋白，如LEA蛋白；有些序列編碼的蛋白與細菌自身蛋白相似，可能對細菌的正常生理功能有干擾作用；此外，我們還篩選獲得了一些功能未知的克隆。 為了進一步鑒定這些克隆的功能，我們對部分篩選到的蛋白質(zhì)編碼基因克隆到了高表達載體pET32a、pET28a和pETlla中，主要結(jié)果如下：