白粉菌誘導的中國野生葡萄cDNA文庫中抗病基因的篩選.pdf

1、在前期的研究中，實驗室以多年鑒定為高抗白粉病的中國野生華東葡萄白河-35-1為材料，采用Clontech SMART‘試劑盒構建了cDNA文庫。在此基礎上，采用抗病基因同源序列法進行克隆與分析，取得的主要研究結果如下： 1.根據(jù)噬菌體在寄主大腸桿菌中能利用重組酶自身環(huán)化成質粒這一原理，將eDNA文庫中的噬菌體環(huán)化成質粒，形成質粒文庫。通過eDNA文庫梯度稀釋試驗，確立了Ecoli BM25.8與eDNA原始文庫的最佳混合比例為2

2、00 μL感受態(tài)BM25.8應與小于≤104 pfu的文庫混合，才可獲得分離良好且菌落數(shù)量滿足篩選要求的環(huán)化cDNA文庫。 2.根據(jù)抗病基因蛋白質N、L6、RPS2上的位于P-環(huán)(P-Loop)上的GVGKTT氨基酸保守結構域設計簡并PCR引物，對環(huán)化cDNA文庫中的菌落進行PCR篩選，對陽性菌落的質粒進一步提取質粒進行PCR檢測，最后對陽性質粒測序，獲得了抗病相關cDNA片段36個。 3.用Blast軟件對葡萄植物36

3、個抗病基因同源類似物(RGA)核苷酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)測得的序列中，大多數(shù)為未知基因序列，利用DNAstar軟件中的ClustalW程序進行多序列比對，將所有序列分為2大類：一類是抗性相關基因，有些與已登陸葡萄抗白粉病基因序列相似，有些與水分脅迫表達基因相似，有些和葡萄抗皮爾斯病基因高度同源；另一類是與果實發(fā)育有關的基因，包括07-No.239、No.80、No.235、No.160、No.100、No.76、No.391、No.190