Egr-1特異脫氧核酶對(duì)大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后PAI-1和TF表達(dá)的影響.pdf

1、前言:
　　 經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PCI)是目前廣泛應(yīng)用的治療冠心病手段之一,但術(shù)后的再狹窄(restenosis,RS)影響了其遠(yuǎn)期療效。研究發(fā)現(xiàn),血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖所致血管內(nèi)膜的增生是Rs的重要病理特征,而血管成形術(shù)后早期富含血小板的血栓形成與VSMC增殖、遷移和轉(zhuǎn)型密切相關(guān)。纖溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)是調(diào)節(jié)纖溶活性的關(guān)鍵因子,早期血栓的發(fā)生和發(fā)展同PAI-1的水平和活性升高有關(guān),抑制高活性PA

2、I-1將對(duì)早期血栓形成及血管再狹窄的防治起到重要作用。TF,又稱組織凝血活酶,是目前已知最有效的凝血途徑天然啟動(dòng)子。PTCA術(shù)引起動(dòng)脈血管內(nèi)膜撕裂,使TF釋放至血液,啟動(dòng)外源性凝血機(jī)制,從而導(dǎo)致局部血栓形成。TF除了有促凝作用外,它作為細(xì)胞膜的受體,可介導(dǎo)SMC的遷移和增生,促進(jìn)Rs發(fā)展。脫氧核酶(deoxyribozyme,DRZ)是一種具有酶催化活性的DNA分子,作為一種基因抑制劑有著實(shí)際的治療作用。早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1(early

3、growthresponsefactor-1,Egr-1)是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子。它在動(dòng)脈損傷等外界刺激下被激活,在早期血栓形成、VSMC的分裂、增殖和內(nèi)膜增生等過(guò)程有著重要的作用。本研究擬在建立血管球囊損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察Egr-1的特異脫氧核酶(10-23DRz,ED5)對(duì)大鼠動(dòng)脈損傷后PAI-1及TF的作用,探討其在血管損傷后抑制內(nèi)膜增生的作用機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 一、合成ED5(由上海

4、博亞生物技術(shù)有限公司合成),堿基序列為:5'-CCGCTGCCAGGCTAGCTACAACGACCCGGGACGT'-3,在其3’和5’端進(jìn)行硫代修飾,5'端用FITC標(biāo)記,以便于在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后基因的分布情況。兩側(cè)下劃線所示部分為寡核苷酸識(shí)別序列。
　　 二、實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)脈損傷的模型建立和基因轉(zhuǎn)染損傷動(dòng)脈:
　　 96只雄性Wistar大白鼠,體重在350-400g,隨機(jī)分為4組。A組為假手術(shù)組;B組為Mgd2

5、對(duì)照組;C組為FuGene6對(duì)照組;D組為ED5+FuGene6轉(zhuǎn)染組。
　　 用10%水合氯醛(0.3mg/g)麻醉后,于無(wú)菌條件下行頸正中切開,鈍性分離左頸總動(dòng)脈近心、遠(yuǎn)心端血流,用2F導(dǎo)管從頸外動(dòng)脈插入左頸總動(dòng)脈內(nèi),推入0.2mL生理鹽水充盈氣囊,反復(fù)抽拉球囊3次,造成左頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷。撤除球囊后,將200μl含有FITC-ED5500μg、轉(zhuǎn)染試劑FuGene630μl、170μlImmol/LMgcl2的溶液局部注入至

6、損傷的血管節(jié)段內(nèi),使其在局部作用20分鐘。轉(zhuǎn)染治療基因24h后,取治療組大鼠局部血管的冰凍切片置于熒光顯微鏡下,用470-490nm光激發(fā),可見殘存血管內(nèi)膜及中膜較對(duì)照組有大量綠色熒光分布,證明轉(zhuǎn)染成功,顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度、分布并拍照。FuGene6組局部注入200μl含有轉(zhuǎn)染試劑FuGene30μl、170μlmmol/LMgcl2的溶液:單純損傷組局部注入200μl1mmol/LMgcl2液;假手術(shù)組只進(jìn)行頸動(dòng)脈結(jié)扎,但不插入導(dǎo)管

7、。術(shù)后結(jié)扎頸外動(dòng)脈,恢復(fù)血流,縫合頸部創(chuàng)口。術(shù)后局部使用青霉素以預(yù)防感染,喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水。術(shù)后3、7、14、21d分批處死動(dòng)物,處死前心臟采血用于ELISA檢測(cè)。取病變處血管用于HE染色檢測(cè)及免疫組化觀察。
　　 三、所用試劑
　　 纖溶酶原激活物抑制劑1、組織因子ELISA試劑盒購(gòu)至R&D公司;ED5購(gòu)自上海博亞生物技術(shù)有限公司合成;轉(zhuǎn)染試劑FuGene6購(gòu)自Roche公司;Egr-1兔抗大鼠單克隆抗體購(gòu)自Sa

8、ntacruz公司
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間的多重比較采用LSD檢驗(yàn),P＜0.05為差異有顯著性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、血管病理形態(tài)學(xué)改變
　　 光鏡下可見:假手術(shù)組,血管內(nèi)膜由一層完整的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋,無(wú)內(nèi)膜增生;大鼠頸總動(dòng)脈拉傷后,可見內(nèi)皮剝脫,說(shuō)明球囊拉傷內(nèi)膜模型

9、成功;血管損傷后3d可見Mgcl2對(duì)照組和FuGene6對(duì)照組內(nèi)膜剝脫,尚無(wú)內(nèi)膜形成,血管壁內(nèi)膜附血小板血栓,ED5組無(wú)血栓形成;血管損傷后7天,Mgcl2組和FuGene6組血管內(nèi)膜可見輕度增生,而ED5組不明顯;損傷后14d內(nèi)膜增生明顯,內(nèi)膜及中膜層有大量的增生細(xì)胞,排列紊亂,內(nèi)彈力板模糊,兩對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性;ED5組內(nèi)膜增生明顯減輕,差異有顯著性(P＜0.01)。
　　 二、Egr-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
　　

10、 正常動(dòng)脈Egr-1表達(dá)微弱,動(dòng)脈損傷后3天、7天、14天至21天,呈持續(xù)高表達(dá),經(jīng)ED5作用后,Egr-1的表達(dá)下降,與同一時(shí)間點(diǎn)的Mgcl2組和FuGene6組比較差異有顯著性(P＜0.01)
　　 三、ELISA結(jié)果分析
　　 (一)各組大鼠血漿PAI-1水平比較分析:
　　 正常血管PAI-1表達(dá)微弱;術(shù)后第3天血漿內(nèi)PAI-1升高,14天開始逐漸下降。經(jīng)ED5作用后,PAI-1的表達(dá)下降,與同一時(shí)問(wèn)點(diǎn)

11、的Mgcl2對(duì)照組、FuGene6對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.01)。兩對(duì)照組之間PAI-1水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。表明ED5在一定程度上抑制內(nèi)皮損傷所誘導(dǎo)的PAI-1的高表達(dá)。
　　 (二)各組大鼠血漿TF的含量比較分析:
　　 用ELISA法測(cè)定不同階段血漿TF表達(dá)量,結(jié)果顯示正常血管TF僅少量表達(dá),經(jīng)球囊擴(kuò)張后Mgcl2組、FuGene6組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)逐漸升高,明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01),Mgcl

12、2組、FuGene6組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)ED5作用后TF表達(dá)水平較同期Mgcl2組、FuGene6組明顯下降(P＜0.01)。
　　 討論:
　　 本研究利用大鼠頸動(dòng)脈損傷模型模擬人PCI術(shù)后再狹窄過(guò)程,以探討血管內(nèi)皮損傷與血漿內(nèi)PAI-1、TF表達(dá)間關(guān)系及其在再狹窄發(fā)生發(fā)展中的意義,以及ED5的干預(yù)作用。
　　 PAI-1是血管損傷愈合中新生內(nèi)膜形成的抑制性調(diào)節(jié)物,主要通過(guò)影響SMC遷移(而非

13、增殖)起作用。球囊損傷后血血漿游離PAI-1水平升高,在局部減少纖溶酶原的激活,促進(jìn)病變血管內(nèi)纖維蛋白和ECM的堆積。PAI-1是纖溶酶原激活物的主要抑制劑,能調(diào)節(jié)纖溶活性和纖溶酶介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶的激活,它的高表達(dá)或活性增高可明顯抑制ECM的降解,而且PAI-1與玻璃體連接蛋白結(jié)合后以更穩(wěn)定的活性形式存在于ECM中,更有利于抑制ECM的降解促進(jìn)RS形成。PAI-1亦參與VSMC的遷移和增殖的調(diào)節(jié)。這些均說(shuō)明PAI-1在再狹窄的

14、形成中起著重要的作用。
　　 TF是體內(nèi)重要的生理性凝血過(guò)程啟動(dòng)子,血管損傷后,細(xì)胞表面的TF暴露,凝血系統(tǒng)在動(dòng)脈局部被激活。TF除了有促凝作用,還可介導(dǎo)SMC的遷移和增生,促進(jìn)RS發(fā)展?，F(xiàn)有的絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為TF即可以來(lái)源于損傷局部的單核細(xì)胞,也可以來(lái)源于粘附聚集的血小板以及暴露于血液的平滑肌細(xì)胞,局部TF的水平可以作為內(nèi)膜增生程度的預(yù)測(cè)因子。然而,除開血管局部以外,TF在外周血中也可以被探及(即血源性TF)。已經(jīng)證實(shí),血源性

15、TF在局部血栓形成過(guò)程中起一定的作用。本實(shí)驗(yàn)觀察了外周血TF水平與血管介入損傷后平滑肌細(xì)胞遷移增生的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)中膜平滑肌遷移增生導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生,外周血TF表達(dá)的水平與內(nèi)膜增生的程度存在正相關(guān)。對(duì)TF表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究,不僅僅會(huì)闡明新的內(nèi)膜增生的分子機(jī)制,而且還有助于研發(fā)新的抑制內(nèi)膜增生的理想藥物。TF可能成為心血管病防治的新的藥用靶點(diǎn)。
　　 脫氧核酶(deoxyribozyme,DRz)是一種具有酶活性的DNA分子,10-2

16、3DRz為其中之一,它具有磷酸酯酶活性,其兩側(cè)的底物識(shí)別序列可與RNA底物特異結(jié)合,而相對(duì)于催化特性結(jié)構(gòu)域的底物RNA鏈中未與催化序列配對(duì)的嘌呤和配對(duì)的嘧啶殘基之間,構(gòu)成特異磷酸二酯酶切割位點(diǎn),從而將底物RNA切斷。ED5正是通過(guò)切割Egr-lmRNA,從而抑制Egr-1的表達(dá),而阻遏動(dòng)脈損傷后的內(nèi)膜增生。
　　 已有研究表明,動(dòng)脈損傷后,在許多被激活的活性物質(zhì)中,Egr-1可能是一種實(shí)用而且理想的防止介入治療后再狹窄的靶因子。

17、這是因?yàn)镋gr-1作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一,偶聯(lián)細(xì)胞外刺激與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),介導(dǎo)30多種下游靶基因的表達(dá),如誘導(dǎo)VSMC的增生和遷移、血小板源性生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。ED5通過(guò)特異性抑制Egr-1的表達(dá)來(lái)阻遏下游靶基因的表達(dá)。目前已經(jīng)明確PAI-1和TF的啟動(dòng)子中含有兩個(gè)富含GC的Egr-1的結(jié)合位點(diǎn),活化的Egr-1可以通過(guò)與這些位點(diǎn)的直接結(jié)合而調(diào)控其表達(dá)。因此ED5這種新型的RNA水平上的強(qiáng)效基因滅火

18、因子,通過(guò)抑制Egr-1的表達(dá),在某種程度上也抑制了PAI-1和TF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而抑制動(dòng)脈損傷后早期血栓形成及新生內(nèi)膜的增生。
　　 病理學(xué)檢查顯示:與Mgcl2對(duì)照組和FuGene6對(duì)照組相比較,術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)ED5轉(zhuǎn)染組血管管腔再狹窄率顯著減小(P＜0.01)。術(shù)后21天時(shí),ED5組血管管腔的狹窄率比Mgcl2對(duì)照組和FuGene6對(duì)照組分別降低了58.90%和60.37%。血管球囊損傷后PAI-1表達(dá)的變化:正常血管PA

19、I-1表達(dá)微弱;動(dòng)脈損傷后3d,血漿內(nèi)PAI-1升高,14天后逐漸下降。經(jīng)ED5作用后,PAI-1的表達(dá)下降,與同一時(shí)間點(diǎn)的Mgcl2對(duì)照組、FuGene6對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.01)。正常血管TF僅少量表達(dá),經(jīng)球囊擴(kuò)張后Mgd2組、FuGene6組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)逐漸升高,明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01),Mgcl2組、FuGene6組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)ED5作用后TF表達(dá)水平較同期Mgd2組、FuGene6組