GDNF及其受體RET在肛門(mén)直腸畸形胎鼠直腸末端的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:觀察膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)及其受體RET在先天性肛門(mén)直腸畸形(ARM)胎鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中直腸末端的表達(dá)和分布情況,探討其對(duì) ARM胚胎期腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響,為ARM患兒術(shù)后排便功能障礙的治療提供理論依據(jù)。
　　方法:選用健康未經(jīng)產(chǎn)成年SD孕鼠40只,生理鹽水對(duì)照組10只和乙烯硫脲組30只,在孕10天時(shí)乙烯硫脲組給予10g/L乙烯硫脲(ETU)(125mg/kg)灌胃制作ARM動(dòng)物模型,對(duì)照組則在孕10d灌胃注

2、入等量生理鹽水。兩組孕鼠分別在孕16、18、20天剖腹取出宮內(nèi)所有胎鼠,肉眼及顯微鏡下觀察兩組肛門(mén)發(fā)育情況,并分三組,生理鹽水對(duì)照組、乙烯硫脲對(duì)照組(未產(chǎn)生ARM胎鼠)、乙烯硫脲畸形組(產(chǎn)生ARM胎鼠)。取胎鼠直腸末端行蘇木素/伊紅(HE)染色,計(jì)算三組胎鼠在16、18、20天直腸末端肌間和黏膜下神經(jīng)叢數(shù)量;通過(guò)免疫組織化學(xué)(IHC)、蛋白印跡(western blot)法檢測(cè)三組胎鼠在不同時(shí)間點(diǎn)直腸末端GDNF及RET蛋白定位及定量表

3、達(dá)情況,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測(cè)三組胎鼠直腸末端GDNF mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　?、偃庋奂敖馄曙@微鏡大體觀:對(duì)照組孕鼠共產(chǎn)胎鼠126只,存活率100％,無(wú)肛門(mén)直腸畸形發(fā)生,無(wú)死胎、發(fā)育不良胎、宮內(nèi)吸收胎等任何畸形,乙烯硫脲孕鼠組共產(chǎn)胎鼠208只,發(fā)生ARM胎鼠123只,發(fā)生率59.135%,除無(wú)肛畸形外,還合并無(wú)尾、短尾、四肢畸形、脊柱裂、腦脊膜或骶脊膜膨出、腹裂、臍膨出等畸形。

4、　?、谌M胎鼠肛門(mén)組織形態(tài)學(xué)改變及直腸末端神經(jīng)叢數(shù)量比較:生理鹽水對(duì)照組胎鼠及ETU對(duì)照組胎鼠肛門(mén)開(kāi)口位置正常,而ETU畸形組胎鼠肛門(mén)開(kāi)口處為一閉合盲端,無(wú)正常肛門(mén)解剖結(jié)構(gòu),直腸末端閉鎖處為增生鱗狀上皮組織及增厚的肌層。生理鹽水對(duì)照組和ETU對(duì)照組胎鼠在16、18、20天直腸末端神經(jīng)叢數(shù)量,兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),三組胎鼠在第16天比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),在18天時(shí),生理鹽水對(duì)照組、ETU對(duì)照組與 ETU

5、畸形組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(11.400±3.134比7.800±1.989,P<0.05;11.200±3.425比7.800±1.989,P<0.05),在第20天時(shí)三組比較差異更為顯著(66.100±4.954比25.200±3.048, P<0.01;67.600±5.481比25.200±3.048,P<0.01),生理鹽水對(duì)照組、ETU對(duì)照組16天、18天與20天比較有顯著性差異(P<0.01),18天的ETU畸形組與16天

6、比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而與20天比較有顯著性差異(P<0.01)。
　?、跥DNF、RET蛋白分布及表達(dá)情況:GDNF、RET主要表達(dá)在胎鼠直腸末端肌間神經(jīng)叢及黏膜下神經(jīng)叢的胞膜及胞質(zhì)中,在第16天三組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),在18和20天生理鹽水對(duì)照組、ETU對(duì)照組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),GDNF、RET在18天生理鹽水對(duì)照組、ETU對(duì)照組與ETU畸形組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(41.62

7、5±3.888比23.281±3.993, P<0.01;41.349±1.799比23.281±3.993,P<0.01;42.000±12.275比27.643±6.540,P<0.05;41.965±10.374比27.643±6.540,P<0.05),GDNF、RET在20天生理鹽水對(duì)照組、ETU對(duì)照組與ETU畸形組比較有顯著性差異(165.209±12.35比48.738±8.262, P<0.01;162.153±13.0

8、20比48.738±8.262,P<0.01;122.107±17.250比40.807±9.933,P<0.01;125.529±18.754比40.807±9.933,P<0.01),GDNF、RET在生理鹽水對(duì)照組和 ETU對(duì)照組18天與16天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而和20天比較有顯著性差異(P<0.01),GDNF、RET在 ETU畸形組18天與16、20天比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而16天和20天比

9、較有顯著性差異(P<0.01)。
　　④GDNF、RET蛋白定量情況:在16天三組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),在18、20天生理鹽水對(duì)照組和ETU對(duì)照組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), GDNF、RET在18天生理鹽水對(duì)照組、ETU對(duì)照組與ETU畸形組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.706±0.076比0.478±0.027,P<0.01;0.686±0.068比0.478±0.027,P<0.01;0.292±0.

10、063比0.105±0.047,P<0.05;0.293±0.093比0.105±0.047,P<0.05),GDNF、RET在20天生理鹽水對(duì)照組、ETU對(duì)照組與 ETU畸形組比較有顯著性差異(1.655±0.063比0.501±0.030, P<0.01;1.589±0.072比0.501±0.030, P<0.01;1.333±0.134比0.208±0.148,P<0.01;1.395±0.194比0.208±0.148,P<0

11、.01),GDNF、RET在生理鹽水對(duì)照組和ETU對(duì)照組18天與16天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而和20天比較有顯著性差異(P<0.01),而ETU畸形組GDNF、RET差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　?、軬DNF mRNA表達(dá)情況:在16天三組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),在18、20天生理鹽水對(duì)照組和ETU對(duì)照組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),GDNF mRNA在18天生理鹽水對(duì)照組、ETU

12、對(duì)照組與ETU畸形組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(103.624±27.533比79.169±11.697, P<0.05;105.184±19.634比79.169±11.697, P<0.05),GDNF mRNA在20天生理鹽水對(duì)照組、ETU對(duì)照組與ETU畸形組比較有顯著性差異(151.496±33.622比94.873±11.309, P<0.01;150.738±21.423比94.873±11.309,P<0.01),在生理鹽水對(duì)照

13、組和ETU對(duì)照組18天與16天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而與20天比較有顯著性差異(P<0.01),GDNF mRNA在ETU畸形組18天與16、20天比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而16天和20天比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　①GDNF及受體 RET在正常胚胎直腸腸壁肌間及粘膜下的分布及表達(dá)是隨著胚胎的不斷發(fā)育逐漸增強(qiáng);而在ARM胎鼠的直腸腸壁肌間及粘膜下的分布及表達(dá)是明顯減弱,并隨著