自主神經系統(tǒng)與角膜的創(chuàng)傷修復.pdf

1、目的:最近研究表明自主神經系統(tǒng)主動地參與免疫應答和炎癥反應過程。本研究旨在觀察自主神經在角膜上皮損傷修復過程中的作用。
　　方法:
　　1.免疫熒光染色
　　使用Anti-酪氨酸羥化酶(TH)分別與Anti-小泡單胺轉運蛋白2(VMAT2)和anti-乙酰膽堿轉移酶(ChAT)進行雙重免疫熒光,觀察交感神經和副交感神經在小鼠角膜中的分布。Anti-β2-腎上腺素能受體(β2-AR)和anti-α7煙堿型乙酰膽堿能受體(

2、α7nAChR)觀察β2-AR和α7nAChR在角膜組織中的表達。
　　2.角膜創(chuàng)傷修復模型建立與觀察
　　在小鼠角膜中央機械性去除2mm上皮層建立創(chuàng)傷模型。觀察了創(chuàng)傷后再上皮化、細胞分裂、白細胞遷移和血小板在角鞏緣血管壁募集的過程。使用交感神經化學切斷劑6-羥基多巴胺(6-OHDA)、β2-腎上腺素受體(β2-AR)激動劑異丙腎上腺素和β2受體拮抗劑噻嗎洛爾檢測了交感神經在創(chuàng)傷修復中的作用。同時使用α7nAChR激動劑尼古

3、丁和拮抗劑美加明檢測了副交感神經在角膜創(chuàng)傷修復中的作用。
　　3.定量分析
　　Photoshop CS4分別計數Anti-Gr-1-FITC、Anti-CD41-PE和DAPI標記的白細胞、血小板和分裂細胞數目;Image-Pro Plus5.1軟件測量Anti-CD31/PECAM-1標記的角膜緣血管直徑。應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析,所有計量結果均以x±s表示。*p<0.05為顯著性差異,**p<0.0

4、1為非常顯著性差異。
　　結果:
　　1.交感神經與角膜創(chuàng)傷修復
　　(1)在角膜上皮層、基質層和角膜緣都存在TH陽性和VMAT2陽性神經纖維,且兩種陽性神經纖維均為β-tubulin III陽性。上皮層交感神經較細小,基質層的卻粗細相互交錯且末梢存在球狀突起,而角膜緣交感神經則緊密分布于血管周圍。
　　(2)角膜緣淋巴管內皮、血管內皮及血管周圍巨噬細胞表達許多β2-AR,其中淋巴管內皮分布較密集。
　　(

5、3)角膜創(chuàng)傷后,完全上皮化在噻嗎洛爾組需18h,切斷交感神經組需24h,對照組30h,異丙腎上腺素組則超過60h,而切斷后使用異丙腎上腺素組60h時可完全上皮化。
　　(4)分裂細胞數目與對照組相比,噻嗎洛爾組在12h呈現高峰,切斷交感神經組為18h,而切斷后使用異丙腎上腺素組和單獨使用異丙腎上腺素組卻一直處于下降趨勢。
　　(5)正常小鼠角膜基底細胞從18h開始進入角膜中央。噻嗎洛爾組基底細胞提前6h進入角膜中央。切斷交感

6、神經組和對照組類似,但是前者基底細胞密度明顯大于后者。異丙腎上腺素和切斷交感神經后使用異丙腎上腺素組基底細胞密度則遠遠小于對照組。
　　(6)創(chuàng)傷后角膜緣白細胞數量在對照組呈現高峰期為18h,切斷后使用異丙腎上腺素組、單獨使用異丙腎上腺素組和噻嗎洛爾組高峰期提前至12h,切斷交感神經組白細胞數量減少。2、3和4區(qū)白細胞的變化趨勢表現為:切斷后使用異丙腎上腺素組、單獨使用異丙腎上腺素組與正常小鼠類似,而切斷交感神經組和噻嗎洛爾組白細

7、胞數量均降低。
　　(7)正常小鼠角膜創(chuàng)傷后動脈直徑持續(xù)緩慢擴張。切斷交感神經組動脈在創(chuàng)傷后12h之前和對照組無差異,而12h之后明顯收縮。噻嗎洛爾組在創(chuàng)傷后至3h急速擴張,3h至18h期間緩慢擴張并達到高峰。異丙腎上腺素組創(chuàng)傷后動脈擴張明顯。切斷后使用異丙腎上腺素組明顯收縮。
　　(8)對照組靜脈創(chuàng)傷后至3h跳躍式擴張,而3h之后緩慢收縮并趨于穩(wěn)定。切斷交感神經組靜脈創(chuàng)傷后至6h緩慢擴張。噻嗎洛爾組擴張趨勢明顯大于對照組。

8、異丙腎上腺素組靜脈創(chuàng)傷后6h之后呈緩慢擴張趨勢。切斷后使用異丙腎上腺素組靜脈創(chuàng)傷后持續(xù)緩慢擴張。
　　(9)創(chuàng)傷后角膜緣血管周圍血小板的聚集在切斷交感神經組和對照組高峰期為18h,但前者的數量遠遠小于后者。噻嗎洛爾組血小板數量高峰期出現在12h,而切斷后使用異丙腎上腺素組和單獨使用異丙腎上腺素組聚集到角膜緣血管的血小板數量均很少。
　　2.副交感神經與角膜創(chuàng)傷修復
　　(1)在角膜基質層和角膜緣都存在β-tubulin

9、 III陽性和ChAT陽性神經纖維,且大部分ChAT陽性神經纖維分布在角膜緣血管周圍。
　　(2)角膜緣血管周圍發(fā)現很多α7nAChR和CD301共陽性細胞。
　　(3)尼古丁組在18h提前完成創(chuàng)面的閉合過程。美加明組在30h仍然沒有完全再上皮化。
　　(4)尼古丁組分裂細胞提前在6h和18h達到波峰期,而美加明組從創(chuàng)傷后分裂細胞數量很少。
　　(5)正常小鼠基底細胞從創(chuàng)傷后18h進入角膜中央。與對照組相比,角膜

10、創(chuàng)傷后尼古丁組從12h開始基底細胞密度便持續(xù)增加。美加明組幾乎無基底細胞。
　　(6)尼古丁組四個區(qū)的白細胞數目均降低,其中1區(qū)最明顯。美加明組高峰期與對照組一致,但數量遠遠高于對照組。
　　(7)正常小鼠角膜創(chuàng)傷后動脈直徑持續(xù)緩慢擴張。尼古丁組在創(chuàng)傷后至12h急速擴張,12h至24h期間持續(xù)緩慢擴張。美加明組動脈明顯擴張。
　　(8)尼古丁組靜脈創(chuàng)傷后至6h緩慢擴張,之后至12h呈收縮趨勢,而12h之后緩慢擴張。而美

11、加明組靜脈創(chuàng)傷后持續(xù)緩慢擴張。
　　(9)尼古丁組血小板高峰期和對照組類似,但是其數量遠遠低于對照組。美加明組血小板募集的數量在創(chuàng)傷后急速持續(xù)增加。
　　結論:
　　1.在角膜上皮層、基質層及角膜緣存在交感神經纖維分布。角膜緣血管、淋巴管和巨噬細胞表達β2受體。交感神經系統(tǒng)興奮抑制角膜上皮創(chuàng)傷后的修復過程:再上皮化延遲、有絲分裂數量下降、嗜中性粒細胞向創(chuàng)傷區(qū)遷移的加速和血小板在角鞏緣血管壁募集過程的抑制。而化學性切除交

12、感神經或使用β受體抑制劑則具有加速角膜上皮創(chuàng)傷后修復過程的作用:再上皮化加速、有絲分裂數量波峰提前和嗜中性粒細胞遷移過程提前。
　　2.在角膜基質層及角膜緣存在副交感神經纖維。角膜緣血管周圍巨噬細胞表達α7nAChR。局部使用α7nAChR激動劑尼古丁可顯著加速角膜上皮創(chuàng)傷后的修復過程:再上皮化提前、有絲分裂數量增加、嗜中性粒細胞向創(chuàng)傷區(qū)遷移的減慢和血小板在角鞏緣血管壁募集過程的抑制。與此相反,α7受體抑制劑則顯著抑制角膜上皮創(chuàng)傷