鼻咽癌腫瘤抗原的血清學(xué)篩選及表達(dá)研究.pdf

1、腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中，惡變的細(xì)胞胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路改變、基因表達(dá)異常、代謝異常，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。以往的研究發(fā)現(xiàn)健康人和腫瘤患者體內(nèi)均存在對腫瘤特異性抗原反應(yīng)的T細(xì)胞前體；在對腫瘤患者的長期追蹤中發(fā)現(xiàn)，部分腫瘤患者經(jīng)適當(dāng)腫瘤抗原肽疫苗免疫后，可以根除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞而長期存活。這些結(jié)果表明，采用適當(dāng)?shù)拿庖吒深A(yù)手段，可以達(dá)到根除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的目的。然而，無論是腫瘤主動免疫治療還是被動免疫治療，前提是必須首先獲得腫瘤抗原，腫瘤抗原的尋找一

2、直是腫瘤免疫學(xué)研究中面臨的重要課題。鼻咽癌在我國發(fā)病率較高，在頭頸部的惡性腫瘤中鼻咽癌的發(fā)病率居首位，以發(fā)現(xiàn)晚和預(yù)后差為特征。對鼻咽癌的病因?qū)W研究表明，其發(fā)生是一個多因素、多階段的過程。目前，鼻咽癌的治療以放療為主，配合全身化療等治療，雖然我們的治療手段和方法在不斷提高和改進(jìn)，但仍有一部分患者預(yù)后較差。以往研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞周圍總有大量的淋巴細(xì)胞浸潤，顯示出很強(qiáng)的免疫原性，說明免疫系統(tǒng)在抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著一定的作用。因此，

3、分離和克隆具有較強(qiáng)免疫原性的鼻咽癌腫瘤抗原對腫瘤的早期診斷與預(yù)后判斷以及腫瘤的免疫治療有著十分重要的理論和實際意義。 為了篩選克隆鼻咽癌特異/相關(guān)抗原，四川大學(xué)華西醫(yī)院人類疾病腫瘤生物治療實驗室自行構(gòu)建了鼻咽癌cDNA表達(dá)文庫，并應(yīng)用鼻咽癌患者的混合血清通過血清學(xué)篩選重組cDNA表達(dá)文庫(SerologicalAnalysisofReecombinantcDNAExpressionLibraries，SEREX)對其腫瘤抗原進(jìn)行

4、初步篩選，獲得了幾種與已知基因具有同源性的抗原基因。 本研究繼續(xù)利用SEREX技術(shù)篩選鼻咽癌cDNA表達(dá)文庫，以求尋找腫瘤特異/相關(guān)性抗原基因。所不同的是，在篩選過程中，根據(jù)異種同源基因在進(jìn)化過程中所形成的細(xì)微差別來打破免疫耐受、增強(qiáng)免疫原性、誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，我們嘗試用鼻咽癌細(xì)胞株培養(yǎng)的細(xì)胞對兔進(jìn)行靜脈注射而使之產(chǎn)生抗癌細(xì)胞抗體，經(jīng)檢測我們獲得了高抗體滴度的異種免疫血清。應(yīng)用這種高抗體滴度的異種(兔)免疫血清，對鼻咽癌c

5、DNA文庫進(jìn)行篩選，陽性克隆產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，相對較易篩選到陽性結(jié)果。 SEREX包括鋪密度為2500-3000pfu/180mm的噬菌體平板，以1：1500稀釋用大腸桿菌Ecolilysate進(jìn)行吸附過的兔免疫血清進(jìn)行篩選。通過篩選1.0×106的噬菌體克隆。經(jīng)過三次復(fù)篩后，得到18個陽性克隆，分別命名為NPC-1～18。將陽性克隆進(jìn)行內(nèi)部剪切，提取質(zhì)粒，并應(yīng)用EcoRI和Xhol進(jìn)行酶切確定插入片斷長度，酶切結(jié)果顯示它們

6、基因片斷的長度從0.3kb-3kb不等。通過對其進(jìn)行核苷酸測序，對所得到的18個獨立的陽性克隆的序列遞交至Genebank進(jìn)行同源性比較，用BlastProgram在nr,est，unigene和chromosome中查詢，分析該序列所包含的生物信息。經(jīng)序列分析這些陽性克?。喝筷栃钥寺〉腸DNA序列與人基因組序列的相似性均大于95％，9個序列與已知蛋白或基因有較高的相似性，在人的Genebank中檢索到了同源基因，其中包括MAGE基因

7、、CREM基因、β2-微球蛋白以及核糖體蛋白等已知基因或EST。在已知基因中，結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因在其中所占的比重較大，說明細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中可能具有特殊的地位。這些基因表達(dá)的變化，改變了腫瘤細(xì)胞的免疫原性，使其成為B細(xì)胞識別的靶抗原。另外有6個基因或EST在GenBank數(shù)據(jù)庫中沒有同源性，可能是新基因或EST。提取正常組織、腫瘤組織及癌細(xì)胞株的RNA，根據(jù)核苷酸測序結(jié)果設(shè)計引物，經(jīng)過RT-PCR檢測未知基因N

8、PC-14、NPC-15、NPC-18在不同組織中的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示NPC-15在各種組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，NPC-18在腫瘤組織或細(xì)胞株中的表達(dá)較正常組織上調(diào)，而NPC-14則為限制性表達(dá)，在我們檢測的正常組織中不表達(dá)，僅在某些腫瘤細(xì)胞株及腫瘤組織中表達(dá)，因而這一基因產(chǎn)物可能屬于CT抗原家族。同時我們應(yīng)用Westernblot和SEREX二次篩選對NPC-14、NPC-15和NPC-18克隆的表達(dá)蛋白進(jìn)行鼻咽癌患者(40例)及正常

9、人群(40例)血清的抗體檢測，結(jié)果顯示在鼻咽癌患者血清中抗NPC-14和NPC-18的抗體陽性率明顯高于正常人群(P＜0.01)。說明該基因片段所表達(dá)蛋白可以被免疫系統(tǒng)識別，產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，可能是一種具有免疫原性的功能基因。而在鼻咽癌患者血清中抗NPC-15的抗體陽性率與正常人相比無顯著性差別，可能是一種結(jié)構(gòu)蛋白基因產(chǎn)物。同時在血清學(xué)檢測過程中發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌個體血清中的抗體陽性表達(dá)率均相對較低，這可能是由于免疫系統(tǒng)在早期發(fā)揮免疫作用的同