基于調(diào)強(qiáng)放療的鼻咽癌血漿EBV DNA和血清學(xué)抗體與生存相關(guān)研究.pdf

1、背景：
　　 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是中國南方和東南亞最為常見的腫瘤之一,尤其在華南地區(qū)發(fā)病率高,具有地域流行性,有“廣東瘤”之稱。在廣東中西部高發(fā)區(qū)的調(diào)查發(fā)現(xiàn),鼻咽癌年發(fā)病率為18.1/10萬,僅次于肺癌和肝癌列惡性腫瘤的第三位。
　　 盡管鼻咽癌的病因?qū)W目前仍然不是非常清晰,但EB病毒與鼻咽癌的關(guān)系已經(jīng)得到確認(rèn)。EB病毒((Epstein-Barr virus,EBV)是人

2、類特異性嗜淋巴細(xì)胞性皰疹病毒,通過唾液傳播,通常潛伏于呼吸道。幾乎所有高發(fā)區(qū)的鼻咽癌患者,在其血液和組織標(biāo)本都可以檢測到EB病毒的存在。
　　 多個(gè)研究表明,與EB病毒抗原相關(guān)的抗體是鼻咽癌早期診斷非常有價(jià)值的標(biāo)記物。目前,常用于鼻咽癌診斷的EBV血清學(xué)檢查項(xiàng)目為IgA-EA和IgA-VCA,尤其在鼻咽癌高發(fā)區(qū),患者EB病毒感染的發(fā)生率很高,鼻咽癌患者血IgA-VCA抗體陽性率為90.0％,IgA-EA抗體陽性率為74.5％,抗

3、體滴度與病毒的感染相關(guān)。
　　 PCR擴(kuò)增技術(shù)(Polymerase chain reaction,PCR)是由美國科學(xué)家Kary Mullis1985年發(fā)明。采用此技術(shù)檢測血漿EBV DNA的定量已成為鼻咽癌臨床診治的一個(gè)非常重要的手段。Mutirangura A和Lo相繼使用熒光定量PCR在鼻咽癌患者的血清和血漿中檢測到EBV—DNA,并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)EBV DNA濃度與腫瘤的分期、預(yù)后相關(guān),Lin等通過對鼻咽原發(fā)腫瘤組織和血漿

4、EBV DNA進(jìn)行測序,發(fā)現(xiàn)二者的基因序列基本一致,證明了血漿中的EBV DNA正是來源于鼻咽癌細(xì)胞,為血漿EBV DNA定量檢測在鼻咽癌臨床診治中的應(yīng)用提供了最直接的理論依據(jù)。
　　 為進(jìn)一步探討鼻咽癌患者血漿EBV DNA濃度與生存的關(guān)系,為個(gè)體化的綜合治療選擇提供分子學(xué)指標(biāo),我們設(shè)計(jì)此前瞻性研究,分為四部分完成.:
　　 一、鼻咽癌血漿EBV DNA、腫瘤體積和生存的相關(guān)分析；
　　 二、鼻咽癌血漿EBV

5、DNA動態(tài)變化對預(yù)后的影響；
　　 三、鼻咽癌血漿EBV-DNA與血清學(xué)抗體對照分析；
　　 四、xMAP技術(shù)檢測鼻咽癌EB病毒多項(xiàng)抗體動力學(xué)研究。
　　 第一章鼻咽癌血漿EBV DNA、腫瘤體積和生存的相關(guān)分析
　　 目的:研究鼻咽癌腫瘤體積與分期的關(guān)系,以及治療前血漿EBV DNA濃度與分期、腫瘤體積的關(guān)系,評價(jià)血漿EBV DNA是否代表腫瘤負(fù)荷、并了解其對預(yù)后的影響。
　　 方法:2004年

6、2月到2008年4月中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的初診鼻咽癌180例,收集患者的臨床資料和治療前后的外周血標(biāo)本,采用RT-PCR檢測EBVDNA,全部患者均采用IMRT計(jì)劃工作站勾畫腫瘤靶區(qū)和計(jì)算腫瘤體積和采用IMRT技術(shù)放療。腫瘤體積和EBV DNA的相關(guān)性采用Spearman correlations分析,Kaplan Meier法計(jì)算和繪制生存曲線,多因素分析采用Cox回歸模型。
　　 結(jié)果:全組中位GTVnx21.60 cm

7、3(范圍1.04～164.59)；頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)體積(GTVnd)20.16cm3(范圍0～82.33)；腫瘤總體積(TTV)31.47 cm3(范圍2.37～164.59)。分期與腫瘤體積之間存在正相關(guān)關(guān)系,腫瘤隨著分期順序性增加,分期之間,腫瘤體積具有顯著差異,同一分期內(nèi),腫瘤體積有重疊。治療前血漿EBVDNA的檢出率為82.78％(149/180),中位EBV DNA為14609 copies/ml(范圍0～5820000),EB

8、V DNA與T分期和鼻咽腫瘤體積(GTVnx)呈正相關(guān)關(guān)系,EBVDNA濃隨著腫瘤體積的增大而升高(p值<0.01),各體積分組之間的差異非常顯著性(p值=0.001)。N分期和頸部淋巴靶體積(GTVnd)與EBv DNA濃度相關(guān),但相關(guān)系數(shù)較小。治療前血漿EBV DNA濃度能較好地反映體內(nèi)腫瘤負(fù)荷。
　　 全組病例中位隨訪時(shí)間為48個(gè)月(范圍25～78個(gè)月),治療結(jié)束時(shí)171例患者達(dá)到臨床完全緩解(CR),9例殘留,其中鼻咽局

9、部殘留4例,頸部淋巴結(jié)殘留4例,鼻咽和頸部殘留1例。CT和/或MRI及病理組織學(xué)證實(shí)復(fù)發(fā)18例,6例局部復(fù)發(fā),區(qū)域復(fù)發(fā)9例,局部和區(qū)域復(fù)發(fā)3例；38例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,其中,骨轉(zhuǎn)移10例,肺轉(zhuǎn)移8,肝轉(zhuǎn)移6,多部位13例；3例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。全組28例死亡,4年總生存率(OS)85.6％；4年無復(fù)發(fā)生存率(LFFS)91.1％；4年無轉(zhuǎn)移生存率(MFS)80％；4年無進(jìn)展生存率(PFS)72.8％。
　　 根據(jù)ROC曲線下面積計(jì)

10、算療前EBV DNA臨界值,診斷復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡的臨界值分別為4703.01、4920、7949.98copies/ml。療前EBV DNA臨界值診斷的敏感性高,位于97.37～100％之間,但特異性較低,位于43.21～49.30％,根據(jù)特異性分析,療前EBV DNA對轉(zhuǎn)移和死亡的預(yù)測價(jià)值一般,對復(fù)發(fā)的預(yù)測價(jià)值較低,但都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。多因素分析結(jié)果顯示,EBV DNA是無進(jìn)展生存和無轉(zhuǎn)移生存的獨(dú)立預(yù)后因素,但對于無復(fù)

11、發(fā)生存沒有意義。腫瘤體積不是獨(dú)立的預(yù)后因素,對無復(fù)發(fā)生存率和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率的影響都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:鼻咽癌腫瘤體積與分期密切相關(guān),腫瘤體積對于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移不是獨(dú)立的預(yù)后因素,可能與本研究組全部患者均采用調(diào)強(qiáng)適形放療技術(shù)有關(guān)。
　　 治療前血漿EBV DNA濃度與分期、腫瘤體積密切相關(guān),能提供準(zhǔn)確的腫瘤負(fù)荷信息。生存分析顯示EBV DNA是無轉(zhuǎn)移生存和無進(jìn)展生存的獨(dú)立預(yù)后因素,有利于在治療前對患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估

12、,篩選出預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)大的患者。其預(yù)后價(jià)值受到特異性不強(qiáng)的限制,需結(jié)合分期系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用。
　　 第二章鼻咽癌EB病毒DNA動態(tài)變化對預(yù)后的影響
　　 目的:分析治療后的不同時(shí)段EBV DNA的動態(tài)變化規(guī)律,探討療后血漿EBVDNA動態(tài)變化對復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測價(jià)值,以及其對預(yù)后和生存的影響。
　　 方法:180例初治鼻咽癌患者分別在以下時(shí)段抽血:治療前一周、誘導(dǎo)化療后、同期放化療前、放療結(jié)束后一周、治療后3個(gè)月、以及

13、治療后1、2、3、4、5年各采血一次,18例復(fù)發(fā)患者在復(fù)發(fā)時(shí)、38例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者在轉(zhuǎn)移時(shí)、以及轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)治療后各采集外周血標(biāo)本一次。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測血漿EBV DNA濃度,Kaplan Meier法計(jì)算和繪制生存曲線,多因素分析采用Cox回歸模型。
　　 結(jié)果:180例患者治療結(jié)束時(shí),EBV DNA陽性率由治療前83.33％下降為治療后19.44％(35/180),中位EBV DNA濃度由治療前下降1.4609copi

14、es/ml至0copied/ml(P<0.01)。療后EBV DNA動力學(xué)顯示持續(xù)緩解組和復(fù)發(fā)組、轉(zhuǎn)移組存在明顯差別,持續(xù)緩解組療后EBV DNA上升幅度低,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移兩組放療結(jié)束時(shí)EBV DNA也迅速下降,中位EBV DNA均為0,療后3～6個(gè)月開始逐漸上升。復(fù)發(fā)組和轉(zhuǎn)移組兩組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)ROC曲線下面積計(jì)算療后EBV DNA臨界值,診斷復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡的臨界值分別為1925、2760、11400 copies/ml,臨

15、界值對于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡診斷的敏感性和特異性分別為92.12～100％、84.38～92.62％,特異性和敏感性均明顯超過治療前EBV DNA。療后臨界值影響預(yù)后的獨(dú)立生存因子,即使治療前EBV DNA濃度高,只要療后EBV DNA波動的范圍低于臨界值,預(yù)后仍然良好,而療前EBV DNA的作用可以忽略；療后EBV DNA持續(xù)超過臨界值的患者預(yù)后差,發(fā)生臨床事件的幾率達(dá)到80.95％。
　　 結(jié)論:本組80.56％鼻咽癌患者治療結(jié)

16、束時(shí)EBV DNA濃度降低至0copied/ml。持續(xù)緩解組患者治療后EBV DNA也存在波動,但波動的幅度較低,轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)兩組患者治療后3～6個(gè)月EBV DNA開始逐步上升。療后EBV DNA對生存預(yù)測的特異性高,達(dá)到84.38～92.62％,敏感性為92.12～100％。療后EBVDNA不僅是無復(fù)發(fā)生存和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存的獨(dú)立預(yù)后因素,也是影響無進(jìn)展生存和總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素,只要療后EBV DNA升高超過臨界值,往往意味著預(yù)后不良

17、,其對預(yù)后和生存的影響超過治療前EBV DNA。
　　 治療前EBV DNA價(jià)值在于提供準(zhǔn)確的腫瘤負(fù)荷信息,在治療前對患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估,篩選出預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)大的患者,其預(yù)后價(jià)值受到特異性不強(qiáng)的限制,需密切結(jié)合療后EBV DNA的變化,如果療后DNA持續(xù)高于臨界值,預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)明顯增加,縮短隨訪間隔是必須的,以便在早期給予及時(shí)的救援治療。建議將療后血漿EBV DNA濃度作為療效監(jiān)測的重要手段。
　　 第三章鼻咽癌血漿EBV-DNA與

18、血清學(xué)抗體對照分析
　　 目的:通過測定鼻咽癌患者IgA-VCA、IgA-EA在治療前后的不同時(shí)段抗體滴度變化,并與EBV DNA濃度的動態(tài)變化進(jìn)行對比,分析兩者診斷和預(yù)后的價(jià)值,以期為臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。
　　 方法:收集180例鼻咽癌患者治療前后的外周血樣本,采用RT-PCR檢測EBVDNA、免疫酶染色法檢測IgA-VCA、ELISA檢測IgA-EA。分析治療前IgA-VCA、IgA-EA與分期、腫瘤體積和EBV DN

19、A的相關(guān)性；對比IgA-VCA、IgA-EA與EBV DNA在治療前、后的動態(tài)變化；采用ROC曲線下面積分別計(jì)算血清學(xué)抗體和EBV DNA的敏感性和特異性；Kaplan Meier法計(jì)算和繪制生存曲線,多因素分析采用Cox回歸模型。
　　 結(jié)果:治療前IgA-VCA陽性率為96.7％,治療后陽性率不變,中位數(shù)由療前1:320降至療后1:160；治療前EA-VCA陽性率為61.67％,治療后陽性率升高至71.11％,中位數(shù)由療前1

20、:20降至療后1:10；EBV DNA陽性率由治療前83.33％降至治療后19.44％,中位數(shù)由治療前14609 copies/ml降至治療后0 copies/ml。EBV DNA在治療前后變化顯著,此外,EBV DNA還與分期相關(guān)(x2=36.32,p=0.001)和腫瘤總體積相關(guān)(x2=58.25,p:0.001),IgA-VCA、IgA-EA與分期和腫瘤體積之間均缺乏相關(guān)性,但I(xiàn)gA-VCA、IgA-EA與EBV DNA之間是具有

21、相關(guān)性的(P<0.001)。治療前、后IgA-VCA、IgA-EA在復(fù)發(fā)組、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組、和持續(xù)緩解組之間不存在顯著性差異；而治療前、后血漿EBV DNA分別在3組之間均顯著差異(P=0.001)。
　　 ROC曲線下面積分析結(jié)果為:療前IgA-VCA、IgA-EA的敏感性分別為:58.52～94.44％、48.28～88.89％；IgA—VCA、IgA—EA特異性分別為24.07～49.01％、25.31～57.62％；療前EB

22、V DNA敏感性為97.37～100％、特異性為43.21～49.67％,治療前血清學(xué)抗體的敏感性和特異性與EBV DNA無顯著差別。療后IgA—VCA、IgA—EA的敏感性分別為:42.86～88.89％、34.43～75％:IgA-VCA、IgA-EA的特異性分別為16.78～63.45％、29.661～72.79％；療后EBV DNA敏感性為92.12～100％；特異性為84.38～92.62％。療后血清學(xué)抗體的敏感性和特異性均較

23、EBV DNA低,差別具有顯著意義(P<.001)。
　　 結(jié)論:療前IgA-VCA、IgA-EA敏感性和特異性與EBV DNA無顯著差別,血清學(xué)抗體可用于鼻咽癌的診斷,但I(xiàn)gA-VCA、IgA-EA與分期、腫瘤體積都缺乏相關(guān)性,不利于鼻咽癌分期和腫瘤負(fù)荷的評估。
　　 療后IgA-VCA、IgA-EA敏感性和特異性均明顯低于EBV DNA,其判斷進(jìn)展和預(yù)后的價(jià)值較低,需和EBV DNA聯(lián)合應(yīng)用。治療后EBV DNA對于

24、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、進(jìn)展、生存預(yù)測的特異性最強(qiáng)。
　　 第四章 xMAP技術(shù)檢測鼻咽癌EB病毒多項(xiàng)抗體動力學(xué)研究
　　 目的:EBV的血清學(xué)檢查廣泛應(yīng)用于鼻咽癌,但傳統(tǒng)的免疫檢測定量分析法受NEB病毒抗體在短時(shí)間內(nèi)變化不大的局限,在我們的研究中,擬采用xMAP的技術(shù),分析8種EBV的生物標(biāo)記物在鼻咽癌治療過程中的動態(tài)變化,分析8項(xiàng)血清EBV抗體的波動對預(yù)后的影響。
　　 方法:應(yīng)用xMAP技術(shù),對35例鼻咽癌患者放療前、

25、中、后8種EBV抗體進(jìn)行檢測,并繪制出抗體動力學(xué)曲線。
　　 結(jié)果:在放療中可以觀察到EBV8種抗體最初的波峰,兩位患者表現(xiàn)為先下降,然后再上升,在隨診期間,大多數(shù)患者的EBV抗體活性都顯示下降。復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者在治療后,可以觀察到EBV抗體水平短時(shí)間的上升。
　　 結(jié)論:鼻咽癌患者放療前、中和放療后隨診期間,8項(xiàng)EBV抗體水平的動態(tài)變化可能和腫瘤細(xì)胞的活性相關(guān),xMAP技術(shù)可以聯(lián)合檢測多項(xiàng)EBV血清學(xué)抗體的變化,通過8