核酸雜交的酶放大鑭系元素發(fā)光時(shí)間分辨熒光分析系統(tǒng)及其試劑的研究.pdf

1、目前生物分析技術(shù)如核酸雜交分析和免疫分析等在各種不同領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，如臨床診斷醫(yī)學(xué)、藥物試驗(yàn)和科學(xué)研究。這些分析通常要求高靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度和簡(jiǎn)潔的的分析方法，可以用來(lái)檢測(cè)生物樣品中的微量待檢物質(zhì)如抗體或者特定核苷酸序列等。放射性核素標(biāo)記可以達(dá)到高靈敏度，但是，目前受到了放射性核素輻射危害及標(biāo)記物有效期短等方面的限制。現(xiàn)在，很多研究工作集中于非同位素標(biāo)記研究。非同位素標(biāo)記主要有酶促比色法、化學(xué)發(fā)光法、生物發(fā)光法和熒光分析法等，其

2、中，酶促比色法靈敏度偏低；化學(xué)發(fā)光法和生物發(fā)光法背景信號(hào)太大且標(biāo)記物穩(wěn)定性略差，靈敏度較低。 酶放大鑭系元素發(fā)光時(shí)間分辨熒光分析，是新近建立起的分析方法，實(shí)質(zhì)是把酶放大鑭系元素發(fā)射的熒光利用時(shí)間分辨熒光技術(shù)測(cè)定的方法，具有良好的發(fā)展前景。本法將生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)的高親和力和放大作用、酶放大作用、鑭系元素螯合物的特有優(yōu)點(diǎn)和時(shí)間分辨測(cè)量技術(shù)結(jié)合，通過(guò)堿性磷酸酶的酶促作用把5-氟水楊酸磷酸酯(5-FSAP)轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟水楊酸(5-

3、FSA)，5-FSA與Tb3+-EDTA熒光發(fā)展溶液形成了發(fā)熒光的三元復(fù)合物，通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度計(jì)算待測(cè)物質(zhì)的含量，是一種高靈敏度的無(wú)放射性污染的分析方法。 本論文的研究目的是研究和建立全新的核酸雜交的酶放大鑭系元素發(fā)光時(shí)間分辨熒光分析系統(tǒng)及研制本分析系統(tǒng)的關(guān)鍵試劑，為酶放大鑭系元素發(fā)光時(shí)間分辨熒光分析的推廣和應(yīng)用打下技術(shù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。 在核酸雜交的酶放大鑭系元素發(fā)光時(shí)間分辨熒光分析系統(tǒng)中，其中的主要試劑或者購(gòu)買不到如5-F

4、SAP等，或者價(jià)格昂貴如堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素(ALP-SA)等，這就需要我們自己研制。 (1)采用戊二醛二步法進(jìn)行堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素的研制，經(jīng)過(guò)純化濃縮，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定產(chǎn)品標(biāo)記物溶液濃度為10.22mg/ml，凝膠電泳法測(cè)定產(chǎn)物分子量約為159kD，鑭系元素發(fā)光時(shí)間分辨熒光法檢測(cè)產(chǎn)物活性為242U/ml，產(chǎn)品為高純度、高生物活性的堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素。堿性磷酸酶標(biāo)記率為43.6％。 (2)為了進(jìn)行核酸雜交

5、分析，必須固相化靶DNA。將一系列含量不同的pBR322DNA用HindⅢ內(nèi)切酶直鏈化并變性后，進(jìn)行固相化。 (3)進(jìn)行了生物素化探針的研制工作：用pBR322DNA變性單鏈為模板，隨機(jī)寡核苷酸為引物，Klenow酶催化合成互補(bǔ)DNA鏈，生物素-16-脫氧尿苷酸摻入合成的互補(bǔ)DNA探針，實(shí)現(xiàn)探針的生物素化，合成了濃度分別為0.13μg/μl和0.11μg/μl兩份生物素化探針。 (4)合成了分析系統(tǒng)中重要的5-氟水楊酸磷

6、酸酯，測(cè)定熔點(diǎn)為157～159℃、純度為99.43％～100％、紅外吸收光譜、紫外吸收光譜及核磁共振譜等特性鑒定與文獻(xiàn)記載一致。 (5)進(jìn)行了Tb3+-EDTA螯合物和熒光發(fā)展溶液的制備，并對(duì)熒光發(fā)展溶液的各種組成成分的含量對(duì)核酸雜交標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響進(jìn)行了分析研究。 成功研制了分析系統(tǒng)中各種主要試劑后，我們建立了核酸雜交的酶放大鑭系元素發(fā)光時(shí)間分辨熒光分析系統(tǒng)，對(duì)pBR322DNA進(jìn)行了含量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)態(tài)范

7、圍寬，可到三個(gè)數(shù)量級(jí)；靈敏度為6pg；準(zhǔn)確度為90％～115％；當(dāng)pBR322DNA的含量為0.05～50ng范圍內(nèi)時(shí)，精密度為10％；并對(duì)影響分析系統(tǒng)穩(wěn)定性和靈敏度的各個(gè)因素，如紫外燈照射時(shí)間、生物素化探針濃度、堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素濃度、5-氟水楊酸磷酸酯濃度、Tb3+-EDTA濃度以及洗滌方法等進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)；觀察到本分析系統(tǒng)中熒光隨測(cè)量時(shí)間延長(zhǎng)而下降的現(xiàn)象，經(jīng)系統(tǒng)充分的研究，解決了此問(wèn)題，并進(jìn)行了理論解釋。 成功建立了