炎癥和高滲因素對角膜上皮干細(xì)胞活性的影響及其機(jī)制的體外研究.pdf

1、目的:通過體外使用炎性分子和高滲透壓處理小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系(TKE2)和原代兔角膜緣干細(xì)胞，分別模擬持續(xù)性炎癥和干眼高滲因素，研究其對角膜上皮干細(xì)胞活性的不同影響及其可能的機(jī)制。
　　方法:1.體外角膜上皮干細(xì)胞模型的建立:(1)小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系(TKE2):采用含BPE和EGF的KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng);(2)原代兔角膜緣干細(xì)胞:新西蘭大白兔6只，耳緣靜脈空氣栓塞處死后剪取其眼球，無菌條件下Dispase-Trypsin

2、/EDTA消化法分離獲得原代兔角膜緣干細(xì)胞，將細(xì)胞以1000個/孔的密度接種于6孔板中，采用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　2.炎性分子對角膜上皮干細(xì)胞活性的影響:用10 ng/ml IFN-γ，IL-1β或TNF-α處理角膜上皮干細(xì)胞8天，篩選對細(xì)胞克隆形成能力影響較大的炎性分子。采用篩選出的IL-1β進(jìn)行進(jìn)一步研究，用不同濃度的IL-1β(0，1，5，10，20 ng/ml)處理角膜上皮干細(xì)胞8天，檢測其對

3、細(xì)胞克隆形成能力及細(xì)胞生存能力的影響。
　　3.高滲因素對角膜上皮干細(xì)胞活性的影響:通過不同濃度的NaCl(0，10，30，60，90 mM)處理角膜上皮干細(xì)胞8天，檢測其對細(xì)胞克隆形成能力及細(xì)胞生存能力的影響。
　　4.炎性分子和高滲因素共同作用對角膜上皮干細(xì)胞克隆形成能力的影響:用10ng/ml IL-1β復(fù)合不同濃度的NaCl處理角膜上皮干細(xì)胞8天，檢測兩種不同因素的疊加對細(xì)胞克隆形成能力的影響。
　　5.炎性分

4、子和高滲因素對角膜上皮干細(xì)胞活性影響的可能機(jī)制研究:通過研究IL-1β或NaCl處理對角膜上皮干細(xì)胞細(xì)胞凋亡和壞死、細(xì)胞周期分布、干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)及活性氧(ROS)水平等方面的影響來探討炎性分子和高滲因素對角膜上皮干細(xì)胞活性影響的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:1.三種不同炎性分子處理TKE2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與對照或IFN-γ處理相比，IL-β和TNF-α處理能顯著影響TKE2細(xì)胞的克隆形成能力和克隆集落大小。用不同濃度IL-1β或NaCl處理T

5、KE2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，隨IL-1β和NaCl濃度的增加，TKE2細(xì)胞克隆形成率和集落直徑的減小呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng);且IL-1β或NaCl同樣能夠顯著影響兔原代角膜緣干細(xì)胞的克隆形成能力。而當(dāng)IL-1β與不同濃度的NaCl共同處理TKE2細(xì)胞時，其克隆形成效率和集落直徑比單獨(dú)用IL-1β處理時減小的更為顯著。不同濃度IL-1β或NaCl處理TKE2細(xì)胞能夠不同程度的影響細(xì)胞的存活，其中高濃度的NaCl對細(xì)胞的存活影響更大。
　　2.高

6、濃度的NaCl(＞60 mM)會造成顯著的細(xì)胞凋亡和壞死，使細(xì)胞周期停滯在G2/M期;而IL-1β幾乎不造成細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布的改變。IL-1β和NaCl可下調(diào)TKE2細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物△Np63的表達(dá)，且NaCl可明顯上調(diào)分化上皮細(xì)胞標(biāo)記物involucrin的表達(dá)。IL-1β和NaCl處理均可升高TKE2細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。
　　結(jié)論:1.炎性分子IL-1β可抑制角膜上皮干細(xì)胞的克隆形成能力。
　　2.NaCl模擬的高