苯扎氯銨對(duì)角膜上皮屏障功能以及角膜內(nèi)皮間隙連接細(xì)胞通訊的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分：局部應(yīng)用前列腺素類藥物對(duì)兔角膜上皮細(xì)胞屏障功能的影響
　　目的：苯扎氯銨(BAK)是滴眼液中最常用的防腐劑之一，大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)，局部長(zhǎng)期使用含BAK的眼部制劑會(huì)出現(xiàn)很多眼部不適癥狀。含BAK的前列腺素類藥物是治療開角性青光眼的一線藥物，臨床上患者往往需要長(zhǎng)期使用，易導(dǎo)致眼睛干澀，結(jié)膜充血等等，然而其作用機(jī)制還不是非常清楚。緊密連接與粘著連接等構(gòu)成了角膜上皮抵御外界病原微生物入

2、侵的第一道生理屏障，對(duì)角膜正常生理功能的維持具有非常重要的作用。本研究擬探討局部應(yīng)用前列腺素類藥物對(duì)角膜上皮細(xì)胞屏障功能的影響及其作用機(jī)制。
　　方法：新西蘭大白兔被隨機(jī)的分成4組，每組12只，右眼為藥物處理組，分別給以貝美前列腺素(0.005％ BAK)，曲伏前列腺素(0.015％ BAK)，拉坦前列腺素(0.02％ BAK)，以及0.02％ BAK，每日一次，持續(xù)30天給藥，對(duì)側(cè)未處理眼作為空白對(duì)照。Schimer實(shí)驗(yàn)用以評(píng)估

3、用藥后淚液分泌的變化，裂隙燈顯微鏡下觀察角膜熒光染色、玫瑰紅染色以及BUT。運(yùn)用活體共聚焦顯微鏡(IVCM)和蘇木素伊紅(HE)染色觀察角膜上皮細(xì)胞層、基質(zhì)層和內(nèi)皮細(xì)胞層的形態(tài)變化?？缒ど掀ぜ?xì)胞電阻(TER)評(píng)估角膜上皮屏障功能，免疫熒光染色觀察緊密連接標(biāo)志物ZO-1、occludin，粘著連接標(biāo)志物β-catenin以及細(xì)胞增殖標(biāo)志物ki67在角膜上皮細(xì)胞中的定位和表達(dá)。TNUEL凋亡試劑盒評(píng)估局部用藥后的角膜上皮細(xì)胞凋亡情況。

4、>　　結(jié)果：藥物處理30d后，貝美前列腺素與曲伏前列腺素實(shí)驗(yàn)組的淚液分泌，BUT，角膜熒光素與玫瑰紅染色與空白對(duì)照組相比無顯著差異，而在0.02％ BAK與拉坦前列腺素實(shí)驗(yàn)組中，淚液分泌減少，BUT縮短，角膜熒光素與玫瑰紅染色評(píng)分增加。HE染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，藥物處理后，角膜形態(tài)無顯著變化。IVCM檢查證實(shí)，與空白對(duì)照組相比，不同前列腺素類藥物實(shí)驗(yàn)組以及BAK處理組，角膜上皮淺表層細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，細(xì)胞體積變大，形態(tài)變得不規(guī)則，基底層細(xì)

5、胞無顯著變化。在角膜基質(zhì)層，與對(duì)照組相比，前列腺素實(shí)驗(yàn)組與BAK處理組的橋樣結(jié)構(gòu)顯著增多。與對(duì)照組相比，所有實(shí)驗(yàn)組的角膜內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均沒有明顯改變。在前列腺素類藥物實(shí)驗(yàn)組，用藥5d后， TER呈現(xiàn)BAK濃度依賴性的下降，0.02％ BAK處理組下降最為顯著。藥物處理5d后， ZO-1和occludin在細(xì)胞膜上的分布破壞，而β-catenin的分布無明顯變化，用藥30d后，ZO-1和occludin以及β-catenin的形態(tài)與

6、結(jié)構(gòu)均發(fā)生了明顯的破壞。ki67在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組無明顯變化，TUNEL試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，局部應(yīng)用前列腺素類藥物和BAK后，凋亡的上皮細(xì)胞數(shù)目明顯增多。
　　結(jié)論：局部應(yīng)用含BAK前列腺素類藥物會(huì)破壞角膜上皮細(xì)胞的屏障功能，進(jìn)一步揭示了防腐劑BAK誘導(dǎo)眼表毒性的相關(guān)機(jī)制，為后續(xù)防腐劑的相關(guān)眼表毒性研究提供了很好的理論依據(jù)。
　　第二部分：防腐劑苯扎氯銨對(duì)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞間隙連接細(xì)胞通訊的影響及機(jī)制研究
　　目的：在正常生理狀

7、態(tài)下，角膜內(nèi)皮間隙連接形成的通道，可讓小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，信號(hào)分子和代謝產(chǎn)物通過，在維持角膜內(nèi)皮的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和新陳代謝中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)角膜內(nèi)皮形成的屏障可有效阻止房水通過旁細(xì)胞通路進(jìn)入角膜基質(zhì)，維持基質(zhì)的相對(duì)脫水狀態(tài)，因而間隙連接與內(nèi)皮屏障共同維持了角膜的透明和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。BAK是眼科最長(zhǎng)用的防腐劑之一，長(zhǎng)期使用含有BAK的滴眼液會(huì)出現(xiàn)很多眼部不適癥狀，如干眼，結(jié)膜鱗狀化生，細(xì)胞凋亡等。本研究主要探索局部應(yīng)用BAK對(duì)角膜內(nèi)皮間隙連接

8、細(xì)胞通訊的影響，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探索。
　　方法：36只新西蘭大白兔被隨機(jī)的分成三組，右眼為藥物處理組，分別給以0.01％ BAK、0.05％ BAK以及0.1％ BAK，每日2次，持續(xù)給藥7d，對(duì)側(cè)未處理眼作為空白對(duì)照。活體共聚焦(IVCM)顯微鏡檢測(cè)角膜內(nèi)皮的形態(tài)變化，免疫熒光技術(shù)檢測(cè)間隙連接標(biāo)志物Cx43在細(xì)胞中的定位和分布。TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況。Western blot和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Cx43和緊密

9、連接標(biāo)志物ZO-1的蛋白和基因表達(dá)水平。免疫沉淀技術(shù)和免疫熒光雙染色技術(shù)評(píng)估Cx43與ZO-1的相互作用。Scrape loading and dye transfer(SLDT)技術(shù)分析BAK對(duì)間隙連接細(xì)胞通訊活性的影響。
　　結(jié)果：局部使用0.05％ BAK和0.1％ BAK，破壞了間隙連接蛋白Cx43以及緊密連接標(biāo)志物ZO-1在角膜內(nèi)皮細(xì)胞中的分布，同時(shí)下調(diào)了Cx43的蛋白表達(dá)水平。高濃度的BAK誘導(dǎo)Cx43發(fā)生磷酸化。免疫

10、熒光共染色和免疫沉淀結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BAK處理7d后，與對(duì)照組相比，Cx43與ZO-1的結(jié)合發(fā)生了破壞，相互作用顯著減弱。SLDT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BAK處理后，間隙連接細(xì)胞通訊的活性（GJIC activity）顯著受到抑制。
　　結(jié)論：BAK通過磷酸化Cx43，破壞Cx43與ZO-1的相互作用，下調(diào)Cx43的蛋白表達(dá)水平，從而破壞角膜內(nèi)皮細(xì)胞的間隙連接細(xì)胞通訊。本研究第一次探討了BAK對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞間隙連接細(xì)胞通訊的影響，為眼科臨床如何合理