含活基質(zhì)細(xì)胞的去上皮羊膜促進(jìn)角膜上皮干細(xì)胞特性的維持和擴(kuò)增.pdf

1、角膜上皮干細(xì)胞存在于角膜緣基底部,嚴(yán)重眼表面疾病常導(dǎo)致角膜上皮干細(xì)胞缺乏,造成患者嚴(yán)重視功能障礙甚至失明。角膜上皮干細(xì)胞體外擴(kuò)增和移植是目前治療嚴(yán)重角膜上皮干細(xì)胞缺乏的有效方法。理想的角膜上皮干細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)是在體外模擬角膜上皮干細(xì)胞所處的微環(huán)境,以保持干細(xì)胞的特性并促進(jìn)干細(xì)胞的增殖。迄今已有不同技術(shù)用于體外擴(kuò)增角膜上皮干細(xì)胞,包括采用不同的載體,經(jīng)過不同處理的供體細(xì)胞,以及不同的培養(yǎng)基等。到目前為止還沒有建立一個標(biāo)準(zhǔn)化的角膜上皮干細(xì)

2、胞體外擴(kuò)增技術(shù)。
　　 目的:羊膜作為一種載體,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于角膜上皮干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。一般認(rèn)為,在體外,它可能作為一種干細(xì)胞的替代微環(huán)境。先前的研究使用有或無上皮的冷凍保存羊膜作為載體,其中不含羊膜來源的活細(xì)胞。本研究擬探討含活細(xì)胞的羊膜基質(zhì)是否可以發(fā)揮微環(huán)境作用,以促進(jìn)角膜上皮干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。
　　 方法:新鮮羊膜組織經(jīng)過DispaseⅡ37℃短暫消化后刮除上皮細(xì)胞,固定于insert環(huán)上,一部分羊膜于-80℃反復(fù)

3、凍融至少三次使基質(zhì)細(xì)胞死亡作為對照組(D-dAM),另外一部分羊膜未作任何處理放入SHEM培養(yǎng)基中為實驗組(L-dAM)。從經(jīng)DispaseⅡ消化過的兔角膜緣組織塊上分離兔角膜緣上皮細(xì)胞片,并轉(zhuǎn)移到去上皮羊膜基質(zhì)上培養(yǎng)大約7天。一部分組織塊在培養(yǎng)前行BrdU標(biāo)記,并示蹤培養(yǎng)7天,一部分培養(yǎng)3天后進(jìn)行標(biāo)記且不行示蹤培養(yǎng)。收集擴(kuò)增的上皮細(xì)胞以3T3細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行克隆培養(yǎng)。在羊膜表面擴(kuò)增的細(xì)胞分別行K12,K14,p63,Ki67的whol

4、e-mount和切片染色,以及Ⅳ型膠原、Ⅶ型膠原的切片免疫熒光染色。同時,收集上皮細(xì)胞,用蛋白印跡法檢測K12,K14,p63,Ki67的表達(dá)。在不用任何消化處理情況下,用刮刀刮取L-dAM和D-dAM上擴(kuò)增的上皮片,以備移植。
　　 結(jié)果:在L-dAM上培養(yǎng)的上皮細(xì)胞排列更緊密,形態(tài)更小且均一。L-dAM組上皮細(xì)胞的克隆形成率明顯比D-dAM組高。示蹤7天的BrdU標(biāo)記保留細(xì)胞在L-dAM組明顯比D-dAM多,而不示蹤的Brd

5、U標(biāo)記細(xì)胞D-dAM稍多,但兩組區(qū)別沒有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫熒光染色及Western blot均顯示L-dAM組的p63和Ki67表達(dá)明顯比D-dAM多,K12在L-dAM組主要在淺層上皮細(xì)胞表達(dá),基底層不表達(dá),D-dAM組細(xì)胞層較少,全層表達(dá)K12,蛋白印跡法結(jié)果顯示D-dAM組K12表達(dá)較多;K14切片染色D-dAM組全層表達(dá),L-dAM組表達(dá)較弱,但蛋白印跡法顯示K14在L-dAM組比D-dAM組稍多。在L-dAM上培養(yǎng)的上皮擴(kuò)增后較