體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與羊膜構(gòu)建角膜上皮細(xì)胞移植片用于眼表重建.pdf

1、研究背景：
　　健全的眼表上皮連同一個穩(wěn)定的角膜前淚膜，是維持角膜生理功能的組織解剖學(xué)基礎(chǔ)。角膜上皮結(jié)構(gòu)完整、功能正常對視力有重要影響，它的更新依賴于角膜緣干細(xì)胞健全的生理功能，由角膜緣基底層的干細(xì)胞增生和分化來取代脫落死亡的細(xì)胞。角膜緣干細(xì)胞作為角膜上皮細(xì)胞增生的儲備力量，在正常情況下能維持眼表的穩(wěn)定狀態(tài)，保持角膜的透明性，其功能缺失即會導(dǎo)致眼表功能失常，從而失去角膜透明性甚至角膜盲，臨床常見的疾病如酸堿化學(xué)傷、先天無虹膜、St

2、evens-Johnson綜合征等，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致眼表組織的廣泛破壞，引起持續(xù)的角膜上皮缺損、慢性炎癥、角膜混濁、新生血管入侵等一系列的角膜損害，嚴(yán)重危及視力。目前臨床針對這一類疾病多采取自體或異體角膜緣干細(xì)胞移植。然而由于自體角膜緣干細(xì)胞取材量小，存在損傷健眼的風(fēng)險，且不適用于雙眼患者，而異體角膜緣干細(xì)胞多由于移植排斥最終導(dǎo)致手術(shù)失敗。因此，尋找一種取材方便、細(xì)胞量大、能替代角膜緣干細(xì)胞功能的細(xì)胞進行移植是解決這一問題的關(guān)鍵。

3、　　目的：
　　本實驗的目的是采用組織工程技術(shù)，探索將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞替代角膜緣干細(xì)胞作為種子細(xì)胞；體外誘導(dǎo)其分化為角膜上皮細(xì)胞后，以羊膜為載體，制成角膜上皮移植片，進行堿燒傷動物模型活體移植，觀察其移植后療效。
　　方法：
　　實驗一：用羊膜和誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建角膜上皮移植片
　　(1)采用percoll密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并純化、傳代，進行免疫細(xì)胞化學(xué)、掃描電鏡觀察

4、，鑒定。
　　(2)用角膜基質(zhì)細(xì)胞對體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化，并進行形態(tài)學(xué)、掃描電鏡、細(xì)胞表面角蛋白鑒定。
　　(3)羊膜制備：無菌條件下取新鮮足月健康產(chǎn)婦的羊膜，經(jīng)胰蛋白酶處理后備用。
　　(4)將誘導(dǎo)的細(xì)胞種植于羊膜制成角膜上皮移植片，對其細(xì)胞生長狀況進行觀察，行免疫熒光鑒定。
　　實驗二：角膜上皮移植片用于角膜堿燒傷大鼠眼表重建
　　(1)制備角膜堿燒傷大鼠模型。
　　(2)燒

5、傷后2w進行移植手術(shù)，分為對照組、單純羊膜移植組、角膜上皮片移植組（每組12只12眼）。術(shù)后不同時間點裂隙燈觀察角膜變化；對術(shù)后4w、10w大鼠角膜評分并進行統(tǒng)計學(xué)分析；術(shù)后2w、4w、10w取三組大鼠眼球分別進行HE、免疫組織化學(xué)染色；術(shù)后10w三組大鼠行角膜共焦激光顯微鏡檢查。
　　結(jié)果：
　　實驗一：用羊膜和誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建角膜上皮移植片
　　(1)經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)分析分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合骨髓間充質(zhì)

6、干細(xì)胞特征。
　　(2)角膜基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)7d后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)及掃描電鏡檢測，均符合角膜上皮細(xì)胞特性。
　　(3)將誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植于經(jīng)胰蛋白酶處理的羊膜，細(xì)胞貼附良好，生長7d后經(jīng)觀察免疫細(xì)胞化學(xué)及形態(tài)學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞本身的形態(tài)及性質(zhì)不發(fā)生改變。
　　實驗二：角膜上皮移植片用于角膜堿燒傷大鼠眼表重建
　　(1)成功制備了角膜堿燒傷大鼠模型。
　　(2)從臨床觀察結(jié)果看，角膜上皮

7、片移植組熒光素鈉著染面積、角膜混濁程度、新生血管面積均好于單純羊膜移植組和對照組；從HE切片看，羊膜組與對照組均有上皮覆蓋現(xiàn)象，但根據(jù)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析，多為結(jié)膜上皮而非角膜上皮，而角膜上皮片移植組的角膜上皮抗體表達陽性，說明角膜上皮片移植組大鼠的角膜已恢復(fù)正常角膜上皮結(jié)構(gòu)；角膜共焦激光顯微鏡結(jié)果與上述結(jié)果相符：10w角膜上皮片移植組的角膜表層上皮細(xì)胞呈多邊形，扁平狀，邊界清晰；單純羊膜移植組表層上皮細(xì)胞排列紊亂，反光增強，對照組