體外誘導骨髓間充質干細胞與羊膜構建角膜上皮細胞移植片用于眼表重建.pdf

1、研究背景：
　　健全的眼表上皮連同一個穩(wěn)定的角膜前淚膜，是維持角膜生理功能的組織解剖學基礎。角膜上皮結構完整、功能正常對視力有重要影響，它的更新依賴于角膜緣干細胞健全的生理功能，由角膜緣基底層的干細胞增生和分化來取代脫落死亡的細胞。角膜緣干細胞作為角膜上皮細胞增生的儲備力量，在正常情況下能維持眼表的穩(wěn)定狀態(tài)，保持角膜的透明性，其功能缺失即會導致眼表功能失常，從而失去角膜透明性甚至角膜盲，臨床常見的疾病如酸堿化學傷、先天無虹膜、St

2、evens-Johnson綜合征等，嚴重的可以導致眼表組織的廣泛破壞，引起持續(xù)的角膜上皮缺損、慢性炎癥、角膜混濁、新生血管入侵等一系列的角膜損害，嚴重危及視力。目前臨床針對這一類疾病多采取自體或異體角膜緣干細胞移植。然而由于自體角膜緣干細胞取材量小，存在損傷健眼的風險，且不適用于雙眼患者，而異體角膜緣干細胞多由于移植排斥最終導致手術失敗。因此，尋找一種取材方便、細胞量大、能替代角膜緣干細胞功能的細胞進行移植是解決這一問題的關鍵。

3、　　目的：
　　本實驗的目的是采用組織工程技術，探索將骨髓間充質干細胞替代角膜緣干細胞作為種子細胞；體外誘導其分化為角膜上皮細胞后，以羊膜為載體，制成角膜上皮移植片，進行堿燒傷動物模型活體移植，觀察其移植后療效。
　　方法：
　　實驗一：用羊膜和誘導的骨髓間充質干細胞構建角膜上皮移植片
　　(1)采用percoll密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞，并純化、傳代，進行免疫細胞化學、掃描電鏡觀察

4、，鑒定。
　　(2)用角膜基質細胞對體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質干細胞進行誘導分化，并進行形態(tài)學、掃描電鏡、細胞表面角蛋白鑒定。
　　(3)羊膜制備：無菌條件下取新鮮足月健康產婦的羊膜，經胰蛋白酶處理后備用。
　　(4)將誘導的細胞種植于羊膜制成角膜上皮移植片，對其細胞生長狀況進行觀察，行免疫熒光鑒定。
　　實驗二：角膜上皮移植片用于角膜堿燒傷大鼠眼表重建
　　(1)制備角膜堿燒傷大鼠模型。
　　(2)燒

5、傷后2w進行移植手術，分為對照組、單純羊膜移植組、角膜上皮片移植組（每組12只12眼）。術后不同時間點裂隙燈觀察角膜變化；對術后4w、10w大鼠角膜評分并進行統(tǒng)計學分析；術后2w、4w、10w取三組大鼠眼球分別進行HE、免疫組織化學染色；術后10w三組大鼠行角膜共焦激光顯微鏡檢查。
　　結果：
　　實驗一：用羊膜和誘導的骨髓間充質干細胞構建角膜上皮移植片
　　(1)經形態(tài)學、免疫細胞化學分析分離培養(yǎng)的細胞符合骨髓間充質

6、干細胞特征。
　　(2)角膜基質細胞誘導7d后的骨髓間充質干細胞經免疫細胞化學及掃描電鏡檢測，均符合角膜上皮細胞特性。
　　(3)將誘導后的骨髓間充質干細胞種植于經胰蛋白酶處理的羊膜，細胞貼附良好，生長7d后經觀察免疫細胞化學及形態(tài)學檢查，發(fā)現(xiàn)細胞本身的形態(tài)及性質不發(fā)生改變。
　　實驗二：角膜上皮移植片用于角膜堿燒傷大鼠眼表重建
　　(1)成功制備了角膜堿燒傷大鼠模型。
　　(2)從臨床觀察結果看，角膜上皮

7、片移植組熒光素鈉著染面積、角膜混濁程度、新生血管面積均好于單純羊膜移植組和對照組；從HE切片看，羊膜組與對照組均有上皮覆蓋現(xiàn)象，但根據免疫組織化學染色結果分析，多為結膜上皮而非角膜上皮，而角膜上皮片移植組的角膜上皮抗體表達陽性，說明角膜上皮片移植組大鼠的角膜已恢復正常角膜上皮結構；角膜共焦激光顯微鏡結果與上述結果相符：10w角膜上皮片移植組的角膜表層上皮細胞呈多邊形，扁平狀，邊界清晰；單純羊膜移植組表層上皮細胞排列紊亂，反光增強，對照組