MiR-918的加工調(diào)節(jié)機(jī)制及其在紅系分化中的功能研究.pdf

1、背景:造血過程是人體內(nèi)各類血細(xì)胞的發(fā)育、成熟的過程。整個(gè)造血分化過程涉及到三個(gè)階段:第一個(gè)階段是造血干細(xì)胞(hemopieticstemcells)階段，這些造血干細(xì)胞能通過自我復(fù)制(selfrenewal)保持自身數(shù)量的穩(wěn)定，同時(shí)又可以分化發(fā)育形成各系的定向祖細(xì)胞(committedprogenitors);第二個(gè)階段是定向祖細(xì)胞階段，這個(gè)階段包括紅系祖細(xì)胞(CFU-E)、巨核系祖細(xì)胞(CFU-MK)、粒-單核系祖細(xì)胞(CFU-GM)

2、，和TB淋巴系祖細(xì)胞(CFU-TB);第三個(gè)階段是前體細(xì)胞(precursors)及其成熟階段，這一階段的細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟為具有各類特殊功能的終末血細(xì)胞，然后釋放進(jìn)入外周血液。紅系分化是體內(nèi)造血分化過程的重要分支。
　　miRNAs是一類具有18-25個(gè)核苷酸、非編碼的微小調(diào)節(jié)性的RNA分子，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與生命調(diào)控的各個(gè)方面，并與多種疾病的產(chǎn)生相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)microRNAs(miRNAs)也參與了紅系分化

3、的調(diào)控過程。
　　目的:本論文主要研究miR-918的加工調(diào)節(jié)以及在紅系分化中的作用機(jī)制。
　　方法:利用實(shí)時(shí)定量PCR(real-timePCR)篩選了一批與紅系分化相關(guān)的miRNA，分別針對這些miRNA的primary、precusor、mature形式設(shè)計(jì)引物，用以檢測在氯化血紅素(hemin)誘導(dǎo)的K562細(xì)胞向紅系分化過程中的表達(dá)變化，收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，確定miR-918在紅系分化的表達(dá)變化。通過5'-rac

4、e實(shí)驗(yàn)和3'-race實(shí)驗(yàn)獲得pri-918的全長轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)一步利用RBPDB軟件隊(duì)pri-918全長進(jìn)行分析，將候選RNA結(jié)合蛋白的si-RNA轉(zhuǎn)染到k562細(xì)胞中，hemin誘導(dǎo)向紅系分化，利用real-timePCR方法檢測miR-918primary和mature的表達(dá)變化。利用RNA-IP、RNA-EMSA、MS2-MBP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證QKI與miR-918的結(jié)合作用。
　　體外合成miR-918mimic，在細(xì)胞系中進(jìn)行過表

5、達(dá)，hemin誘導(dǎo)，用real-timePCR方法檢測γ-globin的表達(dá)變化，用流式分析紅系分化的表面標(biāo)記CD235a/CD71的表達(dá)表達(dá)。隨后在臍帶血來源的CD34+干細(xì)胞中利用慢病毒進(jìn)行miR-918的過表達(dá)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測相應(yīng)變化。進(jìn)一步構(gòu)建可以降低QKI-5表達(dá)的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，檢測r-globin的變化和紅系分化表面標(biāo)記的變化。
　　利用軟件分析，找到miR-918的若干候選靶基因，將這些候選基因3'UTR

6、區(qū)包含miRNA結(jié)合位點(diǎn)的序列克隆入熒光素酶報(bào)告基因的下游，與miR-918mimic共轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞后檢測報(bào)告基因的表達(dá)情況，采用雙熒光實(shí)驗(yàn)和westernblot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證這些靶基因。
　　結(jié)果:miR-918在紅系分化過程中有表達(dá)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)RNA結(jié)合蛋白QKI-5和miR-918存在直接作用;過表達(dá)miR-918，使得hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞中血紅蛋白合成受阻，紅系分化標(biāo)志CD235a/CD71受到顯著抑制，表明

7、miR-918抑制紅系分化。在原代培養(yǎng)的CD34+干細(xì)胞中過表達(dá)miR-918得到的結(jié)果與上述細(xì)胞系中一致。而且，抑制K562細(xì)胞中QKI-5表達(dá)后促進(jìn)紅系分化，表明QKI參與miR-918的加工成熟。
　　雙熒光實(shí)驗(yàn)表明包含有TAL1和c-MYB基因3'UTR的報(bào)告基因的表達(dá)可以被miR-918明顯抑制;突變相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)序列，這種抑制作用消失。Westernblot也證實(shí)在K562細(xì)胞中過表達(dá)miR-918，TAL1和c-MY