線粒體呼吸鏈相關(guān)基因在不同碳源條件下對白念珠菌菌絲形成的影響.pdf

1、念珠菌是人體的條件致病真菌，可在皮膚上寄生或引起口腔炎、食道炎、陰道炎等疾病。在免疫力低下的人群中還可引起嚴重的播散性念珠菌病，常常危及生命。隨著放化療、移植以及艾滋病病人的增加，念珠菌病已經(jīng)成為威脅這些病人生命的主要殺手，是主要的致死性并發(fā)癥之一。近年來，深部真菌感染的人數(shù)劇增，其中80％以上是念珠菌感染。2010年，美國一項有關(guān)院內(nèi)感染的調(diào)查發(fā)現(xiàn)念珠菌感染居第四位，而且病死率極高。在所有念珠菌中，白念珠菌毒力最強、臨床上最常見。因此

2、，白念珠菌已成為真菌研究的重點。臨床上白念珠菌的致病率和致死率逐年攀升，除了與一些長期抗生素的濫用引起的腸道菌群紊亂有關(guān)，同時白念珠菌的生物被膜因其強大的致病性和耐藥性也逐漸引起人們關(guān)注。生物被膜常常存在于移植物的表面與感染相伴隨而具有重要的臨床意義。有文獻指出一些設備如靜脈導管、起搏器、人工關(guān)節(jié)等在美國的應用已經(jīng)非常普遍，每年有超過100萬患者是該類人群。這些設備提供一些潛在的健康效益但是同時相關(guān)的感染率提高到30％。基于白念珠菌生物

3、膜重大的臨床意義，對白念珠菌生物膜形成機制的研究有利于我們對白念珠菌的致病性和耐藥性進行深入的了解。
　　體外的研究表明白念珠菌生物膜形成一般分為四個階段。(1)首先是白念珠菌酵母態(tài)細胞的粘附和定植，(2)酵母細胞的增長和擴增以小菌落的形式偶聯(lián)于基底層，(3)假菌絲和菌絲的生長與細胞外基質(zhì)產(chǎn)生共存，(4)白念珠菌的酵母態(tài)細胞從生物膜擴散至其它新的位置，我們利用10％小牛血清+spider培養(yǎng)基[3]，37℃，200rpm為培養(yǎng)條件

4、在體外誘導白念珠菌生物膜生成，篩選實驗室菌株庫里存在的300個利用基因重組的方法敲除的白念珠菌基因缺失株，進而篩選出影響白念珠菌生物膜形成的基因，從而尋找出新的對白念珠菌生物膜形成有意義的基因。我們利用體外觀察生物膜形成的方法篩選出4個白念珠菌基因缺失株，他們的菌株編號分別是M6(ORF19.287),M36(ORF19.1625), M58(ORF19.2570), M136(ORF19.6607),我們通過XTT法和Biomass的

5、方法進一步驗證了其生物膜的形成缺陷。然后我們利用白念珠菌基因庫數(shù)據(jù)查找這四個基因的功能，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)這四個白念珠菌突變株所缺失的基因具有相似的功能，都具有NADPH的功能且與線粒體呼吸鏈相關(guān)。因為它們沒有明確的基因名稱，所以我們將篩選出的菌株稱為線粒體呼吸鏈相關(guān)基因(Mitochondrial respiratory chain related gene, MRCRG)缺失株。
　　真菌可以通過糖酵解和有氧呼吸兩種途徑利用碳源獲得

6、能量用于合成代謝，而由電子呼吸鏈傳遞所提供的能量是真菌生長所需的主要能量來源。當線粒體呼吸鏈相關(guān)基因缺乏時，白念珠菌的有氧呼吸受到限制，這時糖酵解成為主要的供能途徑。白念珠菌生長所需的碳源分為發(fā)酵碳源和非發(fā)酵碳源，發(fā)酵碳源包括葡萄糖、果糖、半乳糖等，發(fā)酵碳源包括甘油、氨基酸、甘露醇等。MRCRG缺失會影響到白念珠菌對碳源的利用，因此線粒體呼吸鏈相關(guān)基因缺失株在發(fā)酵碳源和非發(fā)酵碳源兩中不同功能物質(zhì)培養(yǎng)條件下，所表現(xiàn)出來的白念珠菌生長，菌絲

7、形成和生物膜形成的差異是我們此次研究的重點。
　　首先，我們利用發(fā)酵碳源（葡萄糖）和非發(fā)酵碳源（甘露醇）為培養(yǎng)條件，通過測量生長曲線和Spot assay兩種方法比較白念珠菌標準菌株SN250和△MRCRG之間的生長差異;同時比較不同碳源培養(yǎng)條件下△MRCRG的生長差異。其次，我們分別用這兩種碳源供能，在37℃，200rpm的培養(yǎng)條件下（誘導菌絲形成的培養(yǎng)條件）[4]比較△MRCRG菌絲形成的差異。最后我們利用不同碳源作為培養(yǎng)基體

8、外誘導白念珠菌生物膜形成，比較△MRCRG在不同碳源培養(yǎng)條件下生物形成的差異。
　　典型的白念珠菌生物膜結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為在基底層有數(shù)層酵母細胞粘附于移植物表面，其在酵母細胞的上方有豐富的細胞外基質(zhì)覆蓋，其間有大量菌絲生長，生物膜的厚度可達50-350μm[5]。介導白念珠菌生物膜形成的關(guān)鍵除了產(chǎn)生豐富的細胞外基質(zhì)外，白念珠菌由酵母向菌絲的形態(tài)學轉(zhuǎn)變也是其不可或缺的一部分，同時，白念珠菌形態(tài)學的轉(zhuǎn)變是其具有侵襲性和致病性的關(guān)鍵。因此為了進

9、一步驗證MRCRG的缺失在不同碳源培養(yǎng)條件下影響白念珠菌菌絲的形成，我們利用文獻[7]提供的誘導菌絲形成的經(jīng)典液培養(yǎng)基YPD和Spider，為了進一步驗證△MRCRG對不同碳源的利用情況，我們以兩種經(jīng)典的誘導菌絲形成的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配置成4種不同碳源的培養(yǎng)基。它們分別是(Ⅰ) YPD(YEP+2％葡萄糖)，(Ⅱ) YEP+2％甘露醇，(Ⅲ) Spider,(Ⅳ)未加甘露醇的Spider+2％葡萄糖。在37℃，200rpm培養(yǎng)條件下，結(jié)果發(fā)

10、現(xiàn)MRCRG缺失株M6在Ⅱ和Ⅲ培養(yǎng)基中始終以酵母態(tài)的形式存在，而在Ⅰ和Ⅳ培養(yǎng)條件下白念珠菌的菌絲生長正常，同時對照組SN250在這4種培養(yǎng)基中菌絲生長均正常。利用測量生長曲線和Spot assay兩種方法評價MRCRG的缺失對白念珠菌在不同碳源培養(yǎng)條件下白念珠菌生長的影響，結(jié)果顯示在Ⅰ培養(yǎng)基中△MRCRG與SN250相比生長輕度受限，而在Ⅲ培養(yǎng)基中與SN250相比△MRCRG生長明顯受限。我們利用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ作為體外培養(yǎng)白念珠菌生物膜

11、的培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SN250在這四種培養(yǎng)基上均能形成完整的生物膜，而△MRCRG僅在Ⅰ和Ⅳ培養(yǎng)基上能形成完整的生物膜，而在Ⅱ和Ⅲ上幾乎無生物膜形成。根據(jù)以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)在MRCRG的缺失影響白念珠菌對甘露醇（非發(fā)酵碳源）的利用供能，進而影響其生長、菌絲形成及生物膜形成。
　　我們發(fā)現(xiàn)MRCRG的缺失影響白念珠菌對甘露醇的利用進而影響其菌絲的生長。我們通過RT-qPCR的方法證實M6在Spider液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)條件下，菌絲