眼咽肌病綜合癥的臨床、病理及分子生物學(xué)特點研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 眼咽肌病綜合癥患者的臨床特點分析
　　本研究選取1995-2013年間于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院和北京大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的18個眼咽肌病綜合癥家系。所有先證者均行肌肉組織冰凍病理檢查及PA BPN1基因篩查。根據(jù)PABPN1基因篩查結(jié)果，明確13個家系共34例患者為OPMD，5個家系共21例患者經(jīng)基因篩查未發(fā)現(xiàn)PA BPN1突變，診斷為OPDM。
　　OPMD組患者平均起病

2、年齡為47.2±11.2歲（27-67歲）。最常見的首發(fā)癥狀為吞咽困難，占53％(18/34)，平均起病年齡為44.8±10.7歲;其次為眼瞼下垂，占26％(9/34)，平均起病年齡為57.8±7.7歲。以吞咽困難為首發(fā)癥狀的患者較以眼瞼下垂首發(fā)的患者起病早(P=0.0036)。截止到最后一次隨訪，入組患者平均病程為15.5±12.6年（1-53年），79％(27/34)的患者出現(xiàn)眼瞼下垂，由此導(dǎo)致的視野受損成為本組患者中最大的困擾;8

3、8％(30/34)出現(xiàn)吞咽困難;53％(18/34)出現(xiàn)眼外肌麻痹;41％(14/34)出現(xiàn)肢體無力，皆以近端為主。同一家系內(nèi)部在首發(fā)癥狀及受累肌肉分布特點方面有高度的一致性。
　　OPDM組患者平均起病年齡為26.4±5.87歲（22-39歲）。本組患者中，最常見的首發(fā)癥狀是四肢肌無力，占38％(8/21)。截止到最后一次隨訪，入組患者平均病程為15.6±8.99年（1-34年），95％(20/21)的患者出現(xiàn)眼瞼下垂和眼外肌麻

4、痹;52％(11/21)出現(xiàn)吞咽困難，4例患者后期僅能進(jìn)食半流質(zhì);57％(12/21)出現(xiàn)肢體無力，皆首先累及肢體遠(yuǎn)端，其中5例患者在起病12～15年后喪失獨立行走能力，需依賴輪椅。以四肢肌無力首發(fā)的家系普遍進(jìn)展較快，2例患者在起病后17年（40歲）由于OPDM相關(guān)的吸入性肺炎及營養(yǎng)不良死亡。同一家系內(nèi)部在起病年齡、首發(fā)癥狀及進(jìn)展速度上具有一致性。
　　第二部分 眼咽肌病綜合癥患者的肌肉病理特點分析
　　18個家系的先證者均

5、行肌肉組織冰凍病理檢查。肌肉標(biāo)本常規(guī)行組織學(xué)、酶組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色，包括蘇木素-伊紅(H&E)、改良Gomori三色(MGT)、高碘酸Schiff反應(yīng)(PAS)、油紅“O”脂肪染色(ORO)、還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶(NADH-TR)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、細(xì)胞色素C氧化酶(COX)、三磷酸腺苷酶(ATPase)（pH4.3，4.6，10.4和10.6）、Dystrophin蛋白（C端，N端，ROD-）、Dysferlin蛋白

6、、（α-，β-，γ-，δ-）Sarcoglycan蛋白和Caveolin-3蛋白染色。其中部分先證者（7例OPMD患者及3例OPDM患者）接受電鏡檢查。本研究對照皆取自因肌無力而行肌肉活檢且病理結(jié)果為正常的肌肉標(biāo)本。
　　OPMD及OPDM肌肉標(biāo)本在光鏡下病理改變相似，都表現(xiàn)為慢性肌源性改變伴肌纖維內(nèi)鑲邊空泡形成。OPMD中鑲邊空泡出現(xiàn)頻率平均為1.1±0.9％;OPDM中平均為4.2±2.1％，較OPMD更為常見（P=0.015

7、9）。此外，OPDM肌肉損害較OPMD顯著，部分標(biāo)本可見呈小群分布的萎縮纖維，壞死伴吞噬，肌內(nèi)膜及間質(zhì)明顯增生。免疫組化染色未見異常。7例OPMD肌肉標(biāo)本行電鏡檢查，其中5例肌細(xì)胞核內(nèi)可見直徑約為8.5nm的管狀細(xì)絲樣包涵體。3例OPDM肌肉標(biāo)本電鏡下未發(fā)現(xiàn)肌核或肌漿內(nèi)管絲樣包涵體。
　　第三部分 眼咽型肌營養(yǎng)不良的分子生物學(xué)特點分析
　　13個OPMD家系均經(jīng)PABPN1基因突變分析確診，先證者的DNA自活檢肌肉組織標(biāo)本中

8、提取，家系成員DNA自外周血提取。
　　本研究人群中共發(fā)現(xiàn)7種基因型，其中10個家系為單純(GCG)異常擴(kuò)增，另3個家系伴有(GCA)的插入。最常見的基因型為(GCG)9(GCA)3(GCG)1，占46％(6/13)。家系1中先證者為復(fù)合雜合突變(GCG)6(GCA)1(GCA)3(GCG)1/(GCG)6(GCA)1(GCG)1(GCA)3(GCG)1;其姐攜帶1個正常等位基因，另一等位基因為(GCG)6(GCA)1(GCG)1

9、(GCA)3(GCG)1;其弟無臨床癥狀，但攜帶(GCG)6(GCA)1(GCA)3(GCG)1多態(tài)，該多態(tài)以往未見報告。
　　結(jié)合表型，單純(GCG)異常擴(kuò)增與伴有(GCA)插入的家系在臨床表現(xiàn)上無明顯差異。起病年齡及表型嚴(yán)重程度與(GCN)擴(kuò)增次數(shù)無明顯相關(guān)。家系1中，先證者發(fā)病早期即出現(xiàn)眼、咽及肢體肌肉的全面受累，而其姐僅有吞咽困難，提示(GCG)6(GCA)1(GCA)3(GCG)1多態(tài)對表型可能具有調(diào)控作用。
　　

10、第四部分 眼咽型遠(yuǎn)端肌病致病基因的探索
　　外顯子序列雖然僅占基因組序列的1％，但卻包含了編碼和調(diào)控蛋白質(zhì)合成的主要信息。在符合孟德爾遺傳模型的疾病中，85％以上的突變位點都位于外顯子區(qū)域。目前，利用全外顯子組測序技術(shù)(Whole Exome Sequencing，WES)已成功定位了超過100種先前未知的疾病致病基因，包括罕見疾病、復(fù)雜疾病、腫瘤等。OPDM的致病基因至今不明且相關(guān)研究甚少，缺乏較大家系且報道寥寥是其重要限制因素

11、。而WES較全基因組測序及家系連鎖分析的突出優(yōu)勢則在于，其可利用小家系，甚至散發(fā)病例完成致病基因的定位工作。故本研究擬利用WES探索OPDM的致病基因。
　　本研究選取家系2中2例患者(Ⅲ7，Ⅲ9)及1例正常人（Ⅲ9之父），自外周血提取全基因組DNA行WES。按照顯性遺傳模型（不完全外顯）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。家系2中其他成員及家系4用來驗證可能的候選基因。
　　3例送檢者平均檢出105641個基因變異位點，包括非同義突變、剪切位點

12、變異，插入及缺失突變。經(jīng)數(shù)據(jù)分析及功能預(yù)測后的篩選，得到52個非同義突變及3個缺失突變。然而經(jīng)Sanger測序驗證，未得到與疾病表型共分離的基因變異位點。
　　結(jié)論：
　　1.OPMD和OPDM為兩種獨立的疾病實體。吞咽困難是我國OPMD患者常見的首發(fā)癥狀，以吞咽困難為首發(fā)癥狀的患者較以眼瞼下垂首發(fā)的患者起病早（P=0.0036）。OPDM患者中以肢體無力首發(fā)或可提示預(yù)后不良。在兩種疾病中，同一家系內(nèi)部的臨床表型都具有家族一

13、致性，提示除致病基因外的其他遺傳背景可能參與調(diào)控OPMD及OPDM的表型。
　　2.我國OPDM患者光鏡下鑲邊空泡較OPMD更為常見(P=0.0159)。
　　3.我國OPMD患者可見PABPN1基因單純(GCG)異常擴(kuò)增，亦可有(GCA)插入突變，同時存在(GCN)11多態(tài)。13個家系檢測到7種PABPN1基因突變類型，提示中國人群中OPMD患者并非來自共同祖先。(GCG)6(GCA)1(GCA)3(GCG)1為我們首次報