骨髓干細(xì)胞移植治療肝硬化與肝功能不全的實(shí)驗(yàn)和臨床研究.pdf

1、一、目的：應(yīng)用兩種不同的骨髓細(xì)胞成份——BMC和MSC分別進(jìn)行了治療大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的研究，并對(duì)兩者的治療效果進(jìn)行了對(duì)比分析，明確BMC和MSC治療實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的有效性，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；為今后臨床治療選擇干細(xì)胞種類提供理論依據(jù)。 二、材料與方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇SPF級(jí)Wistat大鼠105只，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào)為2002-009，20048023，2004A068)，雌性，

2、4周齡，體重200～300克。其中5只留作空白對(duì)照組，100只作肝硬化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀谩?F344大鼠5只作提取骨髓干細(xì)胞用，由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，為SPF級(jí)，雄性，2周齡，體重150～200克。F344大鼠購(gòu)買后即處死提取骨髓干細(xì)胞。 所有動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，每籠5只，予以編號(hào)，由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)在同一有空調(diào)的無(wú)菌層流架內(nèi)，每日接受相同時(shí)段的光照，食料和飲水不加限制。 2.肝纖維化/肝硬化模

3、型的建立四氯化碳(CCl<,4>)綜合法誘導(dǎo)Wistar大鼠肝硬化模型：大鼠注射CCl<,4>前用30﹪酒精灌胃，約3ml/只。每次皮下注射CCl<,4>前均需測(cè)量體重，根據(jù)體重變化，調(diào)整CCl<,4>劑量。第一天給大鼠皮下注射50﹪四氯化碳植物油溶液，劑量為0.6ml/100g體重。4天后給予同濃度的四氯化碳植物油溶液皮下注射，劑量為0.3ml/100mg。以后每周2次行皮下注射，每次劑量均為0.3ml/1.00mg。第5周始每周隨機(jī)

4、處死1只大鼠觀察肝纖維化形成情況，造模至第8周時(shí)肝臟病理檢查示明顯肝硬化改變，造模成功。 3.BMC的采集和分離選用雄性2周齡的SPF級(jí)F344大鼠，引頸法處死，70﹪乙醇浸泡消毒1分鐘。無(wú)菌條件下分離股骨、脛骨，剔盡附著組織，斷開骨端，暴露骨髓腔。12號(hào)針頭在生長(zhǎng)面開孔，10ml注射器抽吸．D-Hanks液反復(fù)清洗骨髓腔，沖至盛有10﹪FBS培養(yǎng)基的無(wú)菌燒杯，吹打成細(xì)胞懸液。采用密度梯度離心法分離BMC，首先將淋巴細(xì)胞分離液置

5、于試管的底部，然后按照1∶1的比例緩慢將細(xì)胞懸液輕輕疊加在淋巴細(xì)胞分離液層面上，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘。取中層云霧狀細(xì)胞混懸液，以1∶2體積比加入L-DMEM重懸細(xì)胞，1200轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去上清。細(xì)胞沉淀加入10ml L-DMEM重懸，1200轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去上清，收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀加入含15﹪FBS的L-DMEM重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)單個(gè)核細(xì)胞數(shù)至6×10<'6>個(gè)/ml，制成BMC細(xì)胞懸液，供移植用。 4.

6、MSC的采集、分離和培養(yǎng)另將部分制成的BMC細(xì)胞懸液采用貼壁培養(yǎng)、傳代方法純化出骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。首先在BMC細(xì)胞懸液中加入含15﹪FBS的L-DMEM，調(diào)整細(xì)胞密度，以2×10<'5>個(gè)細(xì)胞/cm<'2>的密度接種于25cm<'2>培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5﹪CO<,2>飽和濕度的CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時(shí)后半量更換新鮮培養(yǎng)液，以后每隔2-3天換液一次，去除未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為原代MSC，記為Pv。接種后約14天

7、，倒置相差顯微鏡觀察貼壁細(xì)胞融合達(dá)80﹪，采用0.25﹪胰蛋白酶于37℃下消化貼壁細(xì)胞3分鐘。加入含：FBS的培養(yǎng)基終止消化，PBS輕輕漂洗2次，加含15﹪FBS的L-DMEM，用吸管輕輕吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，按1∶3的比例重新接種細(xì)胞，此為傳代培養(yǎng)的第一代，記為P<,1>。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，細(xì)胞融合度達(dá)80﹪時(shí)再傳代培養(yǎng)，記為P<,2>，依此類推，記為P<,3>、P<,4>。傳至第五代時(shí)，在細(xì)胞輸注給動(dòng)物模型前，用低糖基

8、本營(yíng)養(yǎng)基(DMEN-LG)重懸、計(jì)數(shù)至MSC細(xì)胞數(shù)為6×10<'6>個(gè)/ml，制成MSC細(xì)胞懸液，供移植用。 5.實(shí)驗(yàn)方法與步驟 (1) 骨髓干細(xì)胞在肝臟內(nèi)的定植情況研究取CCl<,4>誘導(dǎo)6周的雌性大鼠5只，乙醚麻醉后，在腹股溝處剪開皮膚，暴露腹股溝靜脈，每只大鼠經(jīng)腹股溝靜脈注入3×10<'6>個(gè)MSC，4周后，處死大鼠，取部分肝組織抽提DNA，以PCR法檢測(cè)雄性大鼠MSC在雌性大鼠肝臟內(nèi)的植入情況。另取DMN誘導(dǎo)10

9、天和20天的雌性大鼠各5只，按上述方法注入同樣劑量的MSC。在DMN誘導(dǎo)的第49天處死大鼠，取部分肝組織抽提DNA，以PCR法檢測(cè)雄性大鼠MSC在雌性大鼠肝臟內(nèi)的植入情況。 MSC的定植檢測(cè)方法：PCR檢測(cè)雄性來(lái)源的大鼠肝臟Y染色體性別決定區(qū)(sex determination region on the Y chromosome，sry)基因在雌性大鼠中的表達(dá)。 (2)骨髓干細(xì)胞移植治療實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的療效評(píng)價(jià)

10、 ●動(dòng)物分組與處理：將肝纖維化/肝硬化成模大鼠60只隨機(jī)分為6組，分別為BMC<,甲>、BMC<,乙>、MSC<,甲>、MSC<,乙>、NS<,甲>、NS<,乙>，每組10只。采用乙醚吸入麻醉，常規(guī)消毒和鋪巾后作右上腹旁正中切口開腹，穿刺門靜脈并留置硅膠針管，以此作為干細(xì)胞移植的通道，根據(jù)不同的組別分別輸入BMC、MSC和生理鹽水(NS)。 -BMC<,甲>組：經(jīng)門靜脈輸入0.5ml共計(jì)3×10<'6>個(gè)BMC，移植后繼續(xù)按

11、造模方法皮下注射CC1<,4>。 -BMC<,乙>組:經(jīng)門靜脈輸入0.5ml共計(jì)3×10<'6>個(gè)BMC，移植后不再作任何處理； -MSC<,甲>組:經(jīng)門靜脈輸入0.5ml共計(jì)3×10<'6>個(gè)MSC，移植后繼續(xù)按造模方法皮下注射CCl<,4>。 -MSC <,Z>組：經(jīng)門靜脈輸入0.5ml共計(jì)3×10<'6>個(gè)MSC，移植后不再作任何處理； -NS<,甲>組:經(jīng)門靜脈輸入0.5ml NS，移植后繼續(xù)按

12、造模方法皮下注射CCl<,4>。 -NS <,Z>組：經(jīng)門靜脈輸入0.5ml NS，移植后不再作任何處理。 ●療效評(píng)價(jià)：以上各組大鼠正常喂養(yǎng)4周后處死，抽取血液并離心分離血清5 ml，同時(shí)切取右肝葉相同部位2.0克一并保存于-80℃低溫冰箱，再取部分右葉肝組織以10﹪福爾馬林溶液固定，做常規(guī)石蠟切片，HE和Masson染色。分別進(jìn)行以下指標(biāo)的檢測(cè)： -一般情況：包括體重、飲食、活動(dòng)、毛色、尿色、大便、皮毛、

13、精神狀態(tài)及存活率以及潰瘍的出現(xiàn)與愈合情況； -肝功能指標(biāo)：包括血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、白蛋白(ALB)和凝血酶原時(shí)間(PT)-肝臟羥脯氨酸和膠原纖維含量：樣本堿水解法測(cè)定肝臟羥脯氨酸含量，圖像定量分析測(cè)定膠原纖維含量-肝纖維化病理學(xué)分級(jí)：按2004年中華病理學(xué)會(huì)的肝纖維化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。 三、結(jié)果 1.骨髓干細(xì)胞在肝臟內(nèi)的定植情況PCR分析顯示兩個(gè)模型中的三個(gè)治療組的肝臟內(nèi)存在雄性供體sry

14、基因的信號(hào)，而空白對(duì)照組和病理對(duì)照組則無(wú)此陽(yáng)性信號(hào)，如下圖所示。 2.骨髓干細(xì)胞移植治療實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的療效 (1)一般情況治療組大鼠皮毛仍蓬亂，晦暗，但食欲較前改善，體重緩慢增加，平均為26.57±8.58 g。其行為及反應(yīng)均較成模時(shí)靈敏，無(wú)腹瀉，舊的潰瘍病灶表面較干燥，部分潰瘍病灶愈合，未見新的潰瘍病灶；而對(duì)照組大鼠皮毛蓬亂而無(wú)光澤，毛色灰暗，食欲不佳，體重?zé)o明顯變化，行動(dòng)及反應(yīng)仍較遲鈍，少數(shù)大鼠出現(xiàn)腹瀉，皮下潰瘍部

15、位未愈合，并出現(xiàn)新的潰瘍病灶。 (2) 肝功能在甲組繼續(xù)皮下注射CCl<,4>時(shí)，NS<,甲>組的ALT、AST均明顯升高，而MSC<,甲>組ALT、AST明顯降低，同時(shí)TP、ALB升高，在BMC<,甲>組ALT、AST也有降低，但降低的程度不如MSC <,甲>組，同樣TP、ALB也有升高，升高的程度也不如MSC<,甲>。NS <,甲>組、BMC <,甲>組、MSC <,甲>組各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組間兩兩(L

16、SD法)比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在乙組未繼續(xù)皮下注射CCl<,4>時(shí)，各組ALT、AST均下降，而且下降至近似正常水平，且三組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TP和ALB升高，升高的三組數(shù)據(jù)比較也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在BMC組、MSC組、NS組各組里，肝功能各指標(biāo)在BMC<,甲> VS BMC<,乙>，MSC<,甲>VS MSC<,乙>，NS<,甲> VS NS<,乙>，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

17、 (3) 大鼠肝臟羥脯氨酸和膠原纖維含量分析兩組大鼠肝臟羥脯氨酸及膠原纖維含量發(fā)現(xiàn)，在繼續(xù)皮下注射CCl<,4>情況下，比較各組間差異顯示BMC <,甲>組與MSC <,甲>組、BMC <,甲>組及NS <,甲>組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而．MSC <,甲>組與NS <,甲>組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。在未繼續(xù)皮下注射CCl<,4>情況下，進(jìn)一步比較各組間差異顯示三組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。進(jìn)