玉米貝殼杉烯合酶功能鑒定及kauralexins關(guān)鍵酶基因An2啟動(dòng)子分析.pdf

1、玉米(Zea mays L.)是重要糧食作物，但病蟲害導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)下降，威脅糧食安全。植保素是植物受病害真菌侵染產(chǎn)生的小分子次生代謝化合物。Kauralexins是玉米中首次發(fā)現(xiàn)的一種二萜植保素，具有良好的抗病原真菌活性，且對(duì)玉米螟幼蟲有拒食作用。Kauralexin具有（異）貝殼杉烯骨架，其生物合成途徑是由柯巴基焦磷酸合酶CPS和（異）貝殼杉烯合酶KS(L)連續(xù)催化前體GGPP形成貝殼杉烯或異貝殼杉烯，進(jìn)一步由細(xì)胞色素P450氧化

2、酶氧化修飾形成。參與kauralexin生物合成的CPS已經(jīng)被鑒定為An2，但其貝殼杉烯合酶還未鑒定。另外植物激素赤霉素的生物合成也需要貝殼杉烯合酶的參與，有報(bào)道稱玉米矮化突變體d5是由于貝殼杉烯合酶基因突變導(dǎo)致赤霉素合成受阻而產(chǎn)生的矮化，但相關(guān)基因還未被鑒定。并且到目前為止，還未有報(bào)道鑒定玉米貝殼杉烯合酶基因，這限制了玉米植保素kauralexin的相關(guān)研究及其應(yīng)用。同時(shí)，植保素積累與其代謝關(guān)鍵基因表達(dá)密切相關(guān)，分析kauralexi

3、n代謝關(guān)鍵基因An2的啟動(dòng)子活性并鑒定其順式元件，能為kauralexin的代謝調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。
　　本研究首先在玉米全基因組中搜索貝殼杉烯合酶，并通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化對(duì)其進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。其中ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1與禾本科植物的貝殼杉烯合酶具有較近的進(jìn)化關(guān)系，即作為候選基因進(jìn)行功能研究。通過(guò)大腸桿菌重組表達(dá)和代謝工程分析，并結(jié)合本氏煙瞬時(shí)表達(dá)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS檢測(cè)確定其生化功能，即催化ent-CPP形成貝殼杉烯。進(jìn)一

4、步通過(guò)亞細(xì)胞定位分析確認(rèn)其功能。同時(shí)分析了這三個(gè)基因在病原菌侵染和激素處理下的表達(dá)模式，并結(jié)合玉米d5矮化突變體確定了這三個(gè)基因的生物學(xué)功能。另外，還利用基因槍瞬時(shí)表達(dá)體系，分析了An2基因啟動(dòng)子的活性區(qū)域。主要結(jié)果如下:
　　1.對(duì)從玉米基因組中搜索出的貝殼杉烯合酶基因，通過(guò)氨基酸序列比對(duì)，與其他禾本科植物的KS(L)s等進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)ZmKSL3與多種植物中參與赤霉素合成的KS的親緣關(guān)系十分相近，而ZmKSL5與ZmT

5、PS1除了本身相近之外，還與小麥中的TaKSL5-1/2相近，它們都不含有γ結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1在玉米二號(hào)染色體上呈現(xiàn)串聯(lián)排列，預(yù)示著這三個(gè)基因在進(jìn)化上可能是串聯(lián)復(fù)制而來(lái)。
　　2.在大腸桿菌重組表達(dá)這三個(gè)基因并通過(guò)代謝工程的方法與玉米中的ent-CPP合酶An2共表達(dá)，GC-MS檢測(cè)產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1都能催化ent-CPP生成貝殼杉烯(ent-kaurene

6、)。前人研究認(rèn)為ZmTPS1為倍半萜合酶，本研究通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)ZmTPS1確實(shí)具有一定的倍半萜合酶活性，能催化FPP產(chǎn)生一系列倍半萜，而ZmKSL3和ZmKSL5則不具有該功能。但進(jìn)一步在本氏煙草中瞬時(shí)表達(dá)這三個(gè)基因，結(jié)果證明它們?cè)谥参矬w內(nèi)也能產(chǎn)生貝殼杉烯。亞細(xì)胞定位分析顯示，這三個(gè)蛋白都定位與質(zhì)體中，符合其貝殼杉烯合酶的功能。因此結(jié)合生物化功能鑒定和亞細(xì)胞定位分析確定這三個(gè)基因均編碼貝殼杉烯合酶。
　　3.對(duì)玉米d5突變體進(jìn)行半定

7、量PCR分析發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因中只有ZmKSL3在d5突變體中不表達(dá)，并且以往轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示其在生長(zhǎng)旺盛的區(qū)域有高表達(dá)，表明ZmKSL3參與赤霉素生物合成。而對(duì)該突變體中ZmKSL3基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)與其野生型母本和B73自交系中的序列相比，突變體中的ZmKSL3在5'-UTR部分起始密碼子之前缺失了100bp的片段，其中包含與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的CAAT元件，這可能就是引起其不表達(dá)的原因。而ZmTPS1或ZmKSL5的突變體均并未出現(xiàn)矮化的表現(xiàn)型

8、，表明不參與赤霉素生物合成。前人研究發(fā)現(xiàn)d5突變體中仍然可檢測(cè)到少量的貝殼杉烯，對(duì)d5突變體中ZmKSL5和ZmTPS1序列進(jìn)行分析未發(fā)現(xiàn)明顯突變，進(jìn)一步進(jìn)行體外生化功能分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因的d5克隆仍然具有貝殼杉烯合酶功能，但可能具有嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制使其不能對(duì)d5突變進(jìn)行補(bǔ)償。
　　4.利用熒光定量PCR，分析了ZmKSL3、ZmKSL5和ZmTPS1在不同處理下的表達(dá)情況，并與kauralexin代謝關(guān)鍵基因An2進(jìn)行比較。研究表

9、明，ZmKSL3在禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)孢子侵染的葉片和ABA處理的根部有少量誘導(dǎo)，這可能與其啟動(dòng)子中所含有的相關(guān)元件有關(guān)。而ZmKSL5和ZmTPS1在禾谷鐮刀菌孢子侵染的葉片、ABA處理的地下部分、MeJA和ETH聯(lián)合處理的葉片和MeJA單獨(dú)處理的葉片中都明顯上調(diào)，并且與An2在這四種處理中的表現(xiàn)呈現(xiàn)正相關(guān)。對(duì)玉米生長(zhǎng)發(fā)育各時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)ZmTPS1和ZmKSL5與An2之間也有相似的表達(dá)模

10、式，而ZmKSL3則不同，這表明ZmTPS1與ZmKSL5參與植保素kauralexin的合成。
　　5.通過(guò)在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)An2啟動(dòng)子中含有2個(gè)W-box，可能與其參與植保素kauralexin的誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)。利用基因槍轟擊介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，在玉米愈傷組織中進(jìn)行了An2基因啟動(dòng)子活性的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不含有第一個(gè)W-box元件的啟動(dòng)子片段A2F2與突變掉第一個(gè)W-box元件的A2F1M都無(wú)法檢測(cè)的啟動(dòng)子活性，而含有第一個(gè)元件的A

11、2F1則能檢測(cè)到活性。這證明能夠介導(dǎo)An2啟動(dòng)子的關(guān)鍵順式元件為其遠(yuǎn)離起始密碼子的第一個(gè)W-box元件，這為研究kaurlexins代謝調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。
　　結(jié)論:本研究鑒定了三個(gè)玉米貝殼杉烯合酶基因，其中一個(gè)參與赤霉素生物合成，為玉米矮化突變體d5的突變基因，而另外兩個(gè)能夠被病原菌侵染和激素處理所誘導(dǎo)，可能參與植保素kauralexin生物合成，同時(shí)這三個(gè)基因在染色體上形成串聯(lián)排列，應(yīng)起源為基因復(fù)制，之后發(fā)生功能異化。對(duì)ka