黑曲霉糖化酶基因啟動(dòng)子功能鑒定及菌株遺傳改良.pdf

1、糖化酶是目前最重要的工業(yè)酶制劑之一，廣泛應(yīng)用于將淀粉糖化產(chǎn)物作為原料的發(fā)酵工業(yè)。AspergillusnigerCICIMF0410是國(guó)內(nèi)生產(chǎn)糖化酶的代表菌株之一。本文克隆了A.nigerF0410糖化酶基因的啟動(dòng)子，對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行了測(cè)定，在大腸桿菌中鑒定了該啟動(dòng)子的功能，并進(jìn)一步探討了其在糖化酶工業(yè)生產(chǎn)菌株遺傳改良中的應(yīng)用。 本文首先通過(guò)PCR擴(kuò)增到A.nigerF0410糖化酶基因啟動(dòng)子PglaA并測(cè)定其核苷酸序列，通過(guò)

2、分析核苷酸序列并與GenBank上登錄號(hào)為X00712的黑曲霉糖化酶基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，兩啟動(dòng)子核苷酸序列同源性為99.45％，有5個(gè)位置的堿基變化，包括1個(gè)位點(diǎn)缺失和4個(gè)位點(diǎn)替換。 將克隆得到的糖化酶基因啟動(dòng)子PglaA替換質(zhì)粒pRS303K上KmR基因啟動(dòng)子，構(gòu)建成糖化酶基因啟動(dòng)子功能檢測(cè)質(zhì)粒pRS-PglaA-KmR，將pRS-PglaA-KmR轉(zhuǎn)入E.coliJM109中，得到重組菌E.coli(pRS-P

3、glaA-KmR)。通過(guò)對(duì)重組菌的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因活性檢測(cè)，表明PglaA在E.coli中具有驅(qū)動(dòng)KmR基因表達(dá)的活性。采用不同誘導(dǎo)物對(duì)該啟動(dòng)子誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖和玉米淀粉，可以不同程度增強(qiáng)PglaA的強(qiáng)度。 用糖化酶基因啟動(dòng)子PglaA替換質(zhì)粒pRS303H上HygR基因啟動(dòng)子，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pRS-PglaA-HygR，通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化糖化酶工業(yè)生產(chǎn)菌株A.nigerF0410，通

4、過(guò)潮霉素B作為篩選標(biāo)記獲得轉(zhuǎn)化子，并通過(guò)PCR對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了進(jìn)一步確認(rèn)，結(jié)果表明成功將重組質(zhì)粒pRS-PglaA-HygR整合到工業(yè)菌株A.nigerF0410染色體中。 通過(guò)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和潮霉素B抗性穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，獲得一株與出發(fā)菌株產(chǎn)糖化酶活力無(wú)明顯改變、抗性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子GAH14，對(duì)其進(jìn)行亞硝基胍誘變，篩選潮霉素B抗性提高的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定其糖化酶酶活。經(jīng)初篩和復(fù)篩，最終獲得了糖化酶活力比出發(fā)菌株提高了8.8％的