自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療陳舊性脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過建立新西蘭大白兔陳舊性脊髓損傷模型，并同時(shí)抽取其自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)、增殖，然后于傷后2周末移植于脊髓損傷部位并同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療，觀察脊髓功能恢復(fù)情況，并于移植術(shù)后6周對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肢體肌力、感覺、括約肌功能的恢復(fù)情況進(jìn)行評(píng)分，并對(duì)最后脊髓組織病理切片進(jìn)行圖像分析，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與僅用常規(guī)治療方法的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，評(píng)價(jià)自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)促進(jìn)造成陳舊性脊髓損傷大白兔的脊髓功能恢

2、復(fù)方面的治療作用。通過該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，為臨床治療陳舊性脊髓損傷積累經(jīng)驗(yàn)。 方法： 1.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)：所有骨髓均從成年新西蘭大白兔自體髂后上嵴處抽取，為保證細(xì)胞濃度，分別從每只新西蘭大白兔左右側(cè)髂后上嵴處抽取骨髓，并在抽取骨髓過程中變換穿刺針方向，每側(cè)各抽取1ml，共2ml，進(jìn)行標(biāo)記編號(hào)。所獲骨髓種植于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。培養(yǎng)液為含20％胎牛血清DMEM液。培養(yǎng)箱溫度37℃，含5％CO2，100％飽和濕度。細(xì)胞傳代密度

3、為1×106/cm2。待第三代細(xì)胞長(zhǎng)滿后，進(jìn)行脊髓移植。 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理：36只新西蘭大耳白兔隨機(jī)分成A、B、C3組，A組12只為對(duì)照組，造成脊髓損傷模型后僅采用常規(guī)治療；B組12只為自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植組。C組12只為自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子治療組。分別觀察各時(shí)段實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為表現(xiàn)，并對(duì)移植術(shù)后6周的脊髓功能進(jìn)行評(píng)分測(cè)定。移植術(shù)后6周處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制作脊髓標(biāo)本組織切片，進(jìn)行光鏡觀察和組織圖象分析

4、。 結(jié)果： 1.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)情況：原代細(xì)胞接種24h，倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)瓶底開始出現(xiàn)少許貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)3～4d，可見細(xì)胞開始呈集落生長(zhǎng)，單個(gè)生長(zhǎng)的細(xì)胞呈短梭形或多角形，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞明顯增多，集落逐漸增大，出現(xiàn)形態(tài)均一、呈放射狀排列的細(xì)胞集落。培養(yǎng)5～7天后細(xì)胞分裂增殖十分明顯，伸出長(zhǎng)短不一、粗細(xì)不均的多種形態(tài)的突起，胞核大，核輪廓不清，核仁清晰，可見較多的分裂相。懸浮細(xì)胞隨著換液次數(shù)的增多而逐漸被

5、去除，約7～10天左右，細(xì)胞融合成單層，長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)瓶。 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)：術(shù)后一周實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無明顯差異，自術(shù)后兩周開始，B、C組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開始運(yùn)動(dòng)增多，雙后肢肌力、痛覺及括約肌功能有一定恢復(fù)，6周時(shí)A組動(dòng)物雙后肢狀況無明顯改善，而B、C組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的雙后肢肌力、痛覺及括約肌功能較前有明顯恢復(fù)，大部分動(dòng)物有自主排尿功能，C組較B組更為明顯。 3.脊髓標(biāo)本切片觀察：見A組鏡下可見脊髓損傷后軸突萎縮壞死或凋亡，細(xì)胞核固

6、縮、碎裂及溶解，損傷的局部炎性出血反應(yīng)，形成脊髓空洞、膠質(zhì)瘢痕增生。而實(shí)驗(yàn)組B、C組見有新生神經(jīng)元及膠質(zhì)纖維細(xì)胞，脊髓空洞數(shù)量較A組明顯少，壞死及萎縮的神經(jīng)元細(xì)胞也較少，且C組好于B組。 結(jié)論： 1.骨髓離心培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合的方法是獲得骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的良好辦法，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞具有良好的體外培養(yǎng)、增殖特性。 2.在體外培養(yǎng)、增殖后的自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞植入陳舊性損傷的脊髓微環(huán)境后，能夠在損傷部位存活、遷移、并與

7、脊髓組織整合，根據(jù)所處的局部微環(huán)境發(fā)生分化，先分化成神經(jīng)元祖細(xì)胞和膠質(zhì)祖細(xì)胞，然后再分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，替換受損的神經(jīng)元，移植的細(xì)胞具有分泌促進(jìn)軸突再生的因子、促進(jìn)損傷軸突的再生并與遠(yuǎn)端軸突建立聯(lián)系，部分恢復(fù)脊髓的傳導(dǎo)功能，自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞無免疫排斥問題，具有良好的治療效果。 3.神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以保護(hù)受損的神經(jīng)元，促進(jìn)受損神經(jīng)元軸突的出芽再生，誘導(dǎo)再生軸突向神經(jīng)纖維生長(zhǎng)，對(duì)移植的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的存活和分化具有明顯促進(jìn)作

8、用，而自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞可以在損傷的脊髓局部存活，有效抑制膠質(zhì)瘢痕的形成，有利于神經(jīng)纖維的再生和長(zhǎng)入，兩者具有一定的協(xié)同作用，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療陳舊性脊髓損傷比單純自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植的治療效果更為理想。 4.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植可以部分恢復(fù)造成陳舊性脊髓損傷的試驗(yàn)動(dòng)物的功能，聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療陳舊性脊髓損傷對(duì)于試驗(yàn)動(dòng)物的脊髓功能的改善有更為理想的作用，可以有效地減輕截癱的程度和改善脊髓功能，但再生