骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外聯(lián)合嗅粘膜來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷.pdf

1、脊髓損傷作為臨床常見(jiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，可導(dǎo)致?lián)p傷平面以下部分或完全的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和自主神經(jīng)功能障礙等嚴(yán)重后果。時(shí)至今日，通過(guò)復(fù)雜的治療和強(qiáng)化的功能訓(xùn)練雖可帶來(lái)少許的恢復(fù)，但治療過(guò)程緩慢，效果有限，并對(duì)較嚴(yán)重的脊髓損傷作用十分有限。目前針對(duì)較嚴(yán)重的脊髓損傷來(lái)說(shuō)臨床上尚無(wú)可獲得顯著功能恢復(fù)的治療手段。干細(xì)胞療法可在實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)修復(fù)的同時(shí)對(duì)功能恢復(fù)有所助益，目前作為脊髓損傷治療的一個(gè)潛在手段被廣泛關(guān)注。本研究將聯(lián)合使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和嗅粘膜來(lái)源神

2、經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行脊髓損傷模型的聯(lián)合移植治療。試圖使兩種細(xì)胞優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，增強(qiáng)其治療能力。其理論依據(jù)在于:由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脊髓損傷的急性期可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，而神經(jīng)干細(xì)胞可以促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)和軸突的重新長(zhǎng)出。
　　第一部分:嗅粘膜來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓間充干細(xì)胞的提取和鑒定
　　目的:
　　使用水平振蕩法提取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并對(duì)其純度和分化能力進(jìn)行鑒定;提取大鼠嗅粘膜來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　方法:

3、r>　　無(wú)菌條件下從股骨和脛骨中抽出骨髓腔內(nèi)的骨髓，反復(fù)吹打?qū)⒐撬杌|(zhì)制成細(xì)胞懸液，離心后貼壁培養(yǎng)。將原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞放入恒溫?fù)u床內(nèi)進(jìn)行搖動(dòng)4小時(shí)，棄上清后傳代培養(yǎng)。使用流式細(xì)胞儀對(duì)獲得的BMSCs的純度進(jìn)行鑒定，成骨成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)證明其分化能力。無(wú)菌條件下剝離大鼠嗅粘膜組織，從中提取神經(jīng)干細(xì)胞，培養(yǎng)后取神經(jīng)球消化傳代。使用免疫組化染色對(duì)所取細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:
　　所獲得的BMSCs，CD29和CD90的陽(yáng)性細(xì)胞比例分

4、別為99.1％和9.19％，而表達(dá)CD31和CD45的陽(yáng)性細(xì)胞比率分別為0％和1.3％。經(jīng)過(guò)成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后，可向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，產(chǎn)生鈣鹽結(jié)節(jié)和脂滴。從嗅粘膜提取的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)可呈典型的神經(jīng)球，使用免疫熒光染色顯示P75、S100、Nestin、GFAP抗體陽(yáng)性。
　　結(jié)論:
　　水平振蕩法可高效穩(wěn)定地獲得大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，減少傳代培養(yǎng)次數(shù)，細(xì)胞純度較高，具有分化潛能。從嗅粘膜提取的神經(jīng)干細(xì)胞具有培養(yǎng)過(guò)程

5、中具有神經(jīng)球的典型特征，神經(jīng)干指標(biāo)鑒定陽(yáng)性。
　　第二部分:大鼠嗅粘膜來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)
　　目的:
　　分析大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和嗅粘膜來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞體外直接共培養(yǎng)后分泌神經(jīng)相關(guān)營(yíng)養(yǎng)因子的情況及對(duì)神經(jīng)元抗凋亡能力的影響。了解大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和嗅粘膜來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞體外間接共培養(yǎng)后的相互作用情況。
　　方法:
　　將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和嗅粘膜來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞體外直接共培養(yǎng)后，測(cè)定其上清

6、液中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的含量，并與單一細(xì)胞上清液進(jìn)行比較。將BMSCs和ONSCs進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)，使用熒光定量PCR測(cè)定共培養(yǎng)及單獨(dú)培養(yǎng)條件下，兩種細(xì)胞mRNA中Nestin、MAP-2、GFAP、Tuj1、NSF-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13表達(dá)含量。提取胎鼠神經(jīng)元細(xì)胞，使用炎癥因子(IL-1β)對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行刺激后，將神經(jīng)元分別與BMSCs、OM-NSCs以及BMSCs混合OM-NSCs

7、進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)，使用TUNNEL和MAP-2免疫熒光染色測(cè)定神經(jīng)元的凋亡率。
　　結(jié)果:
　　單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，BMSCs培養(yǎng)上清液中含NGF最多含NT-3最少，而OM-NSCs中含NT-3最多而NGF最少，直接共培養(yǎng)后上清液的NGF和NT-3含量居中。經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)后BMSCs比單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)MMP-2、MMP-9和MMP-13表達(dá)量降低而MAP-2、GFAP、Tuj1表達(dá)量增高;Nestin先降低，后升高，而NSF-1先升高后降低。

8、經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)后OM-NSCs比單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)NSF-1表達(dá)量降低而Nestin、MAP-2、GFAP、Tuj1、MMP-2、MMP-9和MMP-13表達(dá)量增高。所有干細(xì)胞都會(huì)對(duì)降低炎癥因子刺激后神經(jīng)元的凋亡率，其中兩種干細(xì)胞混合后的效果最為明顯。
　　結(jié)論:
　　兩種干細(xì)胞直接共培養(yǎng)后分泌的生長(zhǎng)因子可互為補(bǔ)充。在非接觸共培養(yǎng)條件下，BMSCs可以幫助OM-NSCs維持干性，OM-NSCs則會(huì)促進(jìn)BMSCs的神經(jīng)分化。OM-NSCs

9、使得BMSCs遷徙能力下降，而BMSCs會(huì)促進(jìn)OM-NSCs遷徙能力的提高。兩種干細(xì)胞混合后，對(duì)神經(jīng)元的抗凋亡能力的保護(hù)最為明顯。
　　第三部分:嗅粘膜來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合移植在治療大鼠脊髓損傷中的作用
　　目的:
　　觀察嗅粘膜來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合移植對(duì)大鼠脊髓損傷的治療效果，并與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或嗅鞘細(xì)胞單獨(dú)移植進(jìn)行比較。
　　方法:
　　制備大鼠下胸段脊髓打擊損傷模型。

10、將造模的大鼠隨機(jī)分為4組，組1，單純BMSCs移植治療組;組2，單純ONSCs移植治療組;組3，BMSCs和ONSCs共移植治療組（兩種細(xì)胞比例1∶1）;組4，無(wú)菌PBS緩沖溶液注射陰性對(duì)照組。在造模后立即進(jìn)行細(xì)胞移植，即在損傷部位周圍注射4×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行治療。于細(xì)胞移植前、移植后第1天、第3天、第7天、第14天對(duì)大鼠進(jìn)行運(yùn)功功能評(píng)估。在移植后14天后處死大鼠，取脊髓病理標(biāo)本進(jìn)免疫熒光染色進(jìn)行評(píng)估。
　　結(jié)果:
　　細(xì)胞

11、移植后第14天，對(duì)照組、BMSCs移植組、OM-NSCs移植組和BMSCs+OM-NSCs移植組的BBB評(píng)分分別為5.6±0.8、7.6±1.1、9.6±1.5和10.8±1.3。其中治療組的評(píng)分均較移對(duì)照組有明顯改善。BMSCs和OM-NSCs聯(lián)合移植組的BBB評(píng)分較兩個(gè)單一干細(xì)胞移植組明顯升高。免疫熒光顯示移植的BMSCs和OM-NSCs均能遷移至脊髓損傷區(qū)，并能在損傷區(qū)存活。
　　結(jié)論:
　　大鼠嗅粘膜來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞和