谷氨酰氨合成酶(GS)在CD44陽性結(jié)直腸癌干細(xì)胞中作用的初步研究.pdf

1、谷氨酰胺代謝是除了葡萄糖代謝以外的腫瘤中最重要的一個(gè)代謝途徑，這條代謝通路在腫瘤的生長，增殖中起到了十分重要的作用。CD44是一種結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞的表面分子標(biāo)志并且其在腫瘤的形成中發(fā)揮了非常重要的作用。研究谷氨酰胺代謝通路中一些關(guān)鍵酶與腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志CD44的相關(guān)性，以及這些酶在CD44+腫瘤干細(xì)胞中的作用對(duì)于研究和了解CSCs具有重要意義。
　　我們收集結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織，用流式細(xì)胞術(shù)檢測了CD44的表達(dá)，并分選出CD

2、44-與CD44+的細(xì)胞，通過RT-PCR檢測谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)代謝酶在CD44+的細(xì)胞和CD44-的細(xì)胞中有明顯的變化。由于臨床標(biāo)本來源有限，我們又用western blot的方法檢測了細(xì)胞系SW480中CD44+和CD44-細(xì)胞代謝酶蛋白水平的變化。發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）在C

3、D44+的細(xì)胞表達(dá)水平是明顯上升的。另外結(jié)直腸癌患者組織切片的免疫熒光提示CD44與GS的共定位良好，二者有明顯的相關(guān)性。
　　P6C是陳佺老師實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的一個(gè)CD44高表達(dá)的結(jié)直腸癌干細(xì)胞系。為了進(jìn)一步研究GS在CD44+腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)，我們構(gòu)建了P6C-GS高表達(dá)、P6C-GS敲低的穩(wěn)定株。另外我們還利用CRISPER-CAS9的技術(shù)構(gòu)建了P6C-GS-敲除的細(xì)胞系。
　　為了進(jìn)一步了解GS在CD44+腫瘤干細(xì)胞中的作

4、用，我們先用P6C-GS高表達(dá)、P6C-GS敲低穩(wěn)定株進(jìn)行平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)GS高表達(dá)時(shí)，P6C的克隆形成能力是增加的。當(dāng)敲低GS時(shí)，P6C的克隆形成能力是下降的。由于P6C是一個(gè)干細(xì)胞系，其形成的克隆90％以上為Holoclone克隆，Holoclone排列緊密，形態(tài)規(guī)則，含有未分化的腫瘤干細(xì)胞，具有較強(qiáng)的成瘤能力。暗示著GS可能影響了腫瘤干細(xì)胞。為了進(jìn)一步探討這種猜測，我們從結(jié)直腸癌細(xì)胞成球能力的角度來分析GS敲低后對(duì)結(jié)直腸癌

5、腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的影響。在P6C中敲除GS后，腫瘤干細(xì)胞的懸浮球形成能力是下降的。
　　mTOR在腫瘤干細(xì)胞中發(fā)揮了很重要的作用。我們通過western blot的方法檢測了GS敲除細(xì)胞中p70S6K蛋白磷酸化水平的變化。提示GS可能通過抑制mTOR信號(hào)從而抑制了結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞的克隆形成和懸浮球形成能力。
　　綜上所述，谷氨酰氨合成酶（GS）在CD44陽性結(jié)直腸癌細(xì)胞的成瘤中發(fā)揮了重要作用。GS能夠促進(jìn)結(jié)腸癌CSC