楊梅花色苷對(duì)胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制探討.pdf

1、本研究屬?lài)?guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目，旨在探討楊梅果實(shí)提取物對(duì)胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)效應(yīng)及其分子機(jī)制，探索其在胰島移植領(lǐng)域的可能應(yīng)用前景，為楊梅花色苷成為一種潛在的胰島保護(hù)劑奠定相應(yīng)理論基礎(chǔ)。我們同時(shí)還初步探討了自噬在胰島體外氧化應(yīng)激損傷及體內(nèi)移植后的發(fā)生。
　　 研究方法：
　　 1、楊梅花色苷對(duì)胰島細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)
　　 （1）楊梅果實(shí)提取物的制備、鑒定及抗氧化活性的測(cè)定
　　 楊梅果實(shí)用含鹽酸的甲醇溶

2、液浸提，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮。提取物中總酚類(lèi)化合物的含量采用Folin-Ciocalteau比色法測(cè)定，總黃酮類(lèi)化合物的含量采用比色法測(cè)定，花色苷含量采用pH示差分光光度法測(cè)定。
　　 采用HPLC對(duì)楊梅花色苷組成進(jìn)行鑒定及含量測(cè)定；采用DPPH方法測(cè)定楊梅花色苷自由基清除活性。MTT法觀察其對(duì)胰島細(xì)胞系INS-1的細(xì)胞毒性。
　　 （2）楊梅花色苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡的影響
　　 采用MTT法觀察花色苷

3、預(yù)處理對(duì)胰島細(xì)胞系的保護(hù)效應(yīng)，用臺(tái)盼藍(lán)據(jù)染實(shí)驗(yàn)及LDH釋放試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 采用ROS特異熒光探針DCF-DA檢測(cè)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡情況，流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡及死亡變化；提取細(xì)胞蛋白，westernblot觀察相關(guān)凋亡蛋白caspase-3,-9及Bcl-2的表達(dá)。
　　 （3）楊梅花色苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞自噬的影響
　　 將mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染I

4、NS-1細(xì)胞后，給予H2O2刺激，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)LC3的點(diǎn)聚情況。電鏡觀察H2O2刺激后細(xì)胞內(nèi)自噬泡的形成。Westernblot觀察H2O2刺激不同時(shí)間后，LC3和BECN1的表達(dá)變化。
　　 采用BECN1 siRNA下調(diào)BECN1表達(dá)，western blot觀察自噬相關(guān)蛋白LC3和凋亡相關(guān)蛋白caspase-9的變化，并進(jìn)一步用MTT法及LDH釋放試驗(yàn)驗(yàn)證。
　　 （4）楊梅花色苷預(yù)處理在腎包膜下移植后早

5、期對(duì)細(xì)胞移植物的影響
　　 將INS-1細(xì)胞移植入糖尿病受體小鼠腎包膜下，72h后取出移植物，部分用4％多聚甲醛固定，部分用戊二醛固定以備做電鏡，部分OCT包埋劑包埋后液氮速凍，-80℃保存以備冰凍切片。石蠟切片行H&E、insulin和BECN-1免疫組化染色及TUNEL染色。冰凍切片行LC3免疫熒光染色，電鏡觀察移植物超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 2.花色苷對(duì)胰島細(xì)胞系保護(hù)機(jī)制的探討
　　 采用RT-PCR及定量PC

6、R檢測(cè)花色苷處理后INS-1細(xì)胞HO-1 mRNA的表達(dá)。western blot方法檢測(cè)HO-1的蛋白表達(dá)水平。
　　 分離小鼠原代胰島，給予花色苷處理，RT-PCR和定量PCR觀察HO-1的表達(dá)。將處理后的胰島冰凍切片并進(jìn)行Insulin和HO-1免疫熒光雙染驗(yàn)證HO-1的表達(dá)。
　　 用HO-1 siRNA下調(diào)HO-1的表達(dá)后，給予luM花色苷24h,western blot檢測(cè)HO-1表達(dá)變化。MTT法檢測(cè)HO-

7、1下調(diào)后花色苷對(duì)胰島細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。Westernblot檢測(cè)caspase-3,-9及LC3的表達(dá)。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.楊梅花色苷對(duì)胰島細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)
　　 （1）楊梅花色苷中最主要的成分為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷
　　 楊梅果實(shí)提取物中花色苷為總黃酮類(lèi)化合物中主要組成部分。對(duì)楊梅花色苷進(jìn)行HPLC分析，發(fā)現(xiàn)矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷為楊梅花色苷最主要成分，比例在90％以上。DPPH法檢測(cè)結(jié)果提示楊

8、梅果實(shí)提取物具有較強(qiáng)的氧自由基清除活性。楊梅花色苷濃度在5uM以?xún)?nèi)時(shí)，對(duì)INS-1細(xì)胞的活性無(wú)明顯影響。
　　 （2）楊梅花色苷減少了H2O2誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞的凋亡和壞死
　　 H2O2刺激導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，并呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性，MTT結(jié)果花色苷預(yù)處理能夠顯著提高細(xì)胞活性，降低H2O2對(duì)其的損傷。臺(tái)盼藍(lán)據(jù)染實(shí)驗(yàn)和LDH釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明luM花色苷預(yù)處理24h可明顯保護(hù)胰島細(xì)胞系抵抗H2O2損傷。PI單染流式檢測(cè)顯示花色苷

9、預(yù)處理明顯減少了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死。
　　 熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示花色苷預(yù)處理減少了H2O2誘導(dǎo)的胞內(nèi)過(guò)量ROS的產(chǎn)生。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示花色苷預(yù)處理減少了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及壞死。Western blot顯示花色苷預(yù)處理減少了H2O2誘導(dǎo)的caspase-3,-9的剪切體的產(chǎn)生，并上調(diào)了Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)一步支持花色苷可減少H2O2誘導(dǎo)的凋亡。
　　 （3）楊梅花色苷減少了H2O2誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞的

10、自噬
　　 mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞，給予H2O2刺激后，熒光顯微鏡觀察到胞漿內(nèi)出現(xiàn)LC3的點(diǎn)聚。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在H2O2處理組細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多明顯的空泡，有腫脹的線粒體及含胞內(nèi)容物的自噬泡。Western blot結(jié)果提示lmMH2O2作用0.5,1,2及4h后，LC3B及BECN1的表達(dá)逐漸上調(diào)，且在2h處表達(dá)量最高。
　　 采用BECN-1 siRNA轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞下調(diào)BECN-1的表達(dá)，

11、降低了H2O2誘導(dǎo)的自噬的發(fā)生。Western blot結(jié)果顯示BECNl siRNA轉(zhuǎn)染后H2O2誘導(dǎo)的caspase-9剪切體表達(dá)下降。MTT實(shí)驗(yàn)及LDH釋放實(shí)驗(yàn)提示抑制自噬減少了H2O2刺激導(dǎo)致的細(xì)胞的損傷。
　　 AO及MDC染色結(jié)果提示花色苷預(yù)處理減少了H2O2刺激導(dǎo)致的胞內(nèi)自噬泡及酸性溶酶體的產(chǎn)生。Western blot結(jié)果顯示H2O2刺激2h后LC3II表達(dá)明顯增加，LC3II/LC3I值增大，而花色苷預(yù)處理則降

12、低了LC3II的表達(dá)和LC3II/LC3I的比例。
　　 （4）楊梅花色苷預(yù)處理對(duì)移植后早期細(xì)胞移植物的影響
　　 INS-1細(xì)胞移植入腎包膜下72h后，取出移植物，insulin免疫組化染色證實(shí)為胰島細(xì)胞系。TUNEL染色顯示部分細(xì)胞移植物在72h時(shí)出現(xiàn)凋亡。免疫組化染色提示BECN1強(qiáng)陽(yáng)性，LC3免疫熒光提示移植物胞漿內(nèi)出現(xiàn)LC3的點(diǎn)聚，電鏡檢查顯示移植物胞漿內(nèi)出現(xiàn)含胞內(nèi)容物的自噬泡，支持自噬的發(fā)生。
　　

13、2.楊梅花色苷保護(hù)胰島的機(jī)制探討
　　 （1）楊梅花色苷濃度及時(shí)間依賴(lài)型的上調(diào)HO-1的表達(dá)
　　 定量PCR及western blot結(jié)果提示花色苷濃度及時(shí)間依賴(lài)的上調(diào)了INS-1細(xì)胞HO-1的表達(dá)。在小鼠胰島細(xì)胞系beta-TC-6，花色苷同樣可濃度依賴(lài)型的上調(diào)HO-1的表達(dá)。
　　 RT-PCR及定量PCR結(jié)果顯示花色苷孵育也明顯上調(diào)了原代胰島HO-1基因表達(dá)水平。胰島冰凍切片Insulin和HO-1免疫熒

14、光雙染提示花色苷處理組胰島細(xì)胞HO-1的表達(dá)水平高于未處理組。
　　 （2）HO-1的上調(diào)表達(dá)參與了花色苷的保護(hù)效應(yīng)
　　 MTT結(jié)果顯示HO-1 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，H2O2刺激后，活性明顯下降，并且降低了花色苷對(duì)INS-1細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。Western blot結(jié)果顯示，與單純H2O2處理組相比，HO-1 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞caspase-3,-9前體表達(dá)水平下降，cleavedcaspase-9表達(dá)增加，同時(shí)L

15、C3II表達(dá)及LC3II/LC3I值增加。
　　 給予空載體與pLNCX2-HO1轉(zhuǎn)染組INS-1細(xì)胞H2O2刺激，MTT結(jié)果顯示HO-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞其活性較對(duì)照組高。LC3免疫熒光染色顯示HO-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞胞內(nèi)LC3點(diǎn)聚程度低于對(duì)照組。
　　 （3）花色苷通過(guò)ERK1/2及PI3K/Akt通路介導(dǎo)HO-1的上調(diào)表達(dá)Western blot結(jié)果提示花色苷濃度及時(shí)間依賴(lài)性的上調(diào)pERK1/2及pAkt的表達(dá)，而JNK通路則未

16、被激活。PD98059及LY294002預(yù)處理抑制了花色苷對(duì)HO-1蛋白的上調(diào)表達(dá)。MTT結(jié)果顯示與單一花色苷處理組相比，PD98059及LY294002預(yù)處理組細(xì)胞活性下降，降低了花色苷對(duì)胰島細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。
　　 （4）花色苷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移
　　 激光共聚焦掃描結(jié)果表明，與未處理組相比，花色苷誘導(dǎo)了部分Nrf2向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。提取細(xì)胞核蛋白，western blot結(jié)果提示luM的花色苷誘導(dǎo)了N

17、rf2在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)。
　　 小結(jié)：
　　 1.楊梅花色苷中最主要成分為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷，其比例占至90％以上。楊梅花色苷具有較強(qiáng)的氧自由基清除能力；其濃度在5uM以?xún)?nèi)時(shí)，對(duì)胰島細(xì)胞系INS-1細(xì)胞無(wú)明顯毒性。
　　 2.花色苷預(yù)處理可以明顯降低H2O2刺激導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)過(guò)量ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而減少氧化應(yīng)激損傷所致的細(xì)胞凋亡和壞死。
　　 3.H2O2刺激除可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死外，還可引起細(xì)胞發(fā)生自噬

18、，且發(fā)生的自噬促進(jìn)細(xì)胞死亡?；ㄉ疹A(yù)處理可以減少H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。
　　 4.細(xì)胞移植入腎包膜下早期，在各類(lèi)刺激下可發(fā)生凋亡和自噬。在移植前予以花色苷預(yù)處理，可降低細(xì)胞移植后凋亡和自噬的發(fā)生程度。
　　 5.花色苷可上調(diào)胰島細(xì)胞（系）HO-1的表達(dá)，且存在明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系和劑量-效應(yīng)關(guān)系。HO-1的上調(diào)表達(dá)可減少H2O2誘導(dǎo)的自噬和凋亡，參與了花色苷對(duì)胰島細(xì)胞的保護(hù)作用?；ㄉ胀ㄟ^(guò)ERK1/2及PI3K/A