骨髓基質(zhì)細(xì)胞與MPEG-PLLA-PLL聚合膜的黏附機(jī)制研究.pdf

1、牙周炎導(dǎo)致的牙周骨的缺損是口腔臨床亟需解決的問(wèn)題，組織工程技術(shù)的應(yīng)用為牙周骨缺損修復(fù)帶來(lái)希望。組織工程包括種子細(xì)胞、支架材料和生長(zhǎng)因子三大要素。種子細(xì)胞與支架材料的黏附是二者相互作用的第一步，在體內(nèi)，細(xì)胞的黏附活動(dòng)受到細(xì)胞表面的整合素等細(xì)胞黏附分子及存在于胞外基質(zhì)中的黏附蛋白的調(diào)節(jié)；在體外，細(xì)胞的黏附受到胞外環(huán)境的影響，尤其是生物支架材料表面的性能的影響。深入了解在細(xì)胞黏附過(guò)程中，黏附分子的參與調(diào)節(jié)及其作用，對(duì)生物材料表面進(jìn)行修飾和改性

2、，有效地提高細(xì)胞對(duì)材料的黏附能力，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞的分化，是組織工程生物支架材料面臨的挑戰(zhàn)。
　　 本課題擬對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和富集，采用掃描電鏡及激光共聚焦掃描顯微鏡觀察BMSCs對(duì)改性材料表面黏附過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化，利用基因分析技術(shù)探討B(tài)MSCs與MPEG-PLLA-PLL聚合膜黏附的基因調(diào)控機(jī)制，對(duì)細(xì)胞與材料整合過(guò)程中黏附分子之間的調(diào)控作用進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究；并對(duì)基因分析中差異表達(dá)的基因進(jìn)行功能分析，篩選出對(duì)初

3、始黏附活動(dòng)起重要作用的基因，闡明BMSCs與MPEG-PLLA-PLL聚合膜初始黏附過(guò)程的分子機(jī)制，為促進(jìn)細(xì)胞黏附的新材料的研制和牙體牙周組織再生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一章 MPEG和PLL對(duì)BMSCs初始黏附中的作用
　　 目的：通過(guò)觀察BMSCs對(duì)MPEG-PLLA和PLLA-PLL兩種聚合膜表面的黏附，探討表面改性基團(tuán)MPEG和PLL對(duì)BMSCs黏附行為的影響。
　　 方法：取第2-6代原代培養(yǎng)BMSCs

4、，接種至PLLA、MPEG-PLLA和PLLA-PLL三種聚合膜和TCP(組織細(xì)胞培養(yǎng)板)表面，分別在DMEM和10％FBS DMEM兩種不同條件下連續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)，定量檢測(cè)黏附細(xì)胞；分別對(duì)培養(yǎng)1小時(shí)、2小時(shí)和24小時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行掃描電鏡觀察；對(duì)培養(yǎng)1小時(shí)和24小時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞骨架蛋白染色，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。
　　 結(jié)果：黏附細(xì)胞定量檢測(cè)結(jié)果顯示，與TCP比較，DMEM培養(yǎng)條件下，MPEG-PLLA和PLLA-PLL兩組聚

5、合膜細(xì)胞黏附量均增高；10％ FBS DMEM培養(yǎng)條件下，兩組聚合膜細(xì)胞黏附量均降低。與PLLA比較，DMEM培養(yǎng)條件下，MPEG-PLLA聚合膜細(xì)胞黏附量增高，MPEG17-PLLA94和MPEG17-PLLA56聚合膜組份細(xì)胞黏附量明顯增高；10％ FBS DMEM培養(yǎng)條件下，MPEG-PLLA聚合膜細(xì)胞黏附量無(wú)明顯改變。在兩種培養(yǎng)條件下，與PLLA比較，PLLA-PLL聚合膜細(xì)胞黏附量均隨改性基團(tuán)PLL含量升高而增高，PLLA77

6、-PLLA72聚合膜組分明顯增高，當(dāng)PLL增高到一定程度(PLLA160-PLL245)，細(xì)胞黏附量下降。
　　 掃描電鏡結(jié)果顯示，連續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)，PLLA聚合膜上細(xì)胞胞體小，形態(tài)呈球形，伸出大量細(xì)長(zhǎng)的偽足，MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上細(xì)胞呈圓餅狀，細(xì)胞邊緣較厚，TCP表面的細(xì)胞扁平舒展，細(xì)胞邊緣與材料貼附；連續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上細(xì)胞胞體增大，并向聚合膜表面伸出較多偽足。連續(xù)

7、培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞移行伸展成梭形，各材料表面細(xì)胞形態(tài)接近。
　　 激光共聚焦掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，連續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)，PLLA聚合膜上細(xì)胞骨架蛋白成環(huán)狀分布于細(xì)胞邊緣，MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上細(xì)胞骨架蛋白成點(diǎn)狀、環(huán)狀或細(xì)絲狀貫穿分布與胞漿中；連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，PLLA聚合膜上細(xì)胞骨架蛋白分布稀疏，MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上細(xì)胞骨架蛋白大量表達(dá)，排列有序。
　　 結(jié)論：改性基團(tuán)MPEG和P

8、LL能直接促進(jìn)BMSCs的黏附：MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜促進(jìn)BMSCs的黏附；細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。
　　 第二章 MPEG-PLLA-PLL表面改性聚合膜對(duì)BMSCs初始黏附的影響
　　 目的：通過(guò)對(duì)MPEG-PLLA-PLL聚合膜表面BMSCs黏附情況的觀察和聚合膜蛋白吸附定量分析，初步探討MPEG-PLLA-PLL對(duì)BMSCs初始黏附的影響和作用機(jī)制。
　　 方法：取第2-6

9、代原代培養(yǎng)BMSCs，接種至PLLA、MPEG-PLLA和四組MPEG-PLLA-PLL聚合膜表面，分別在DMEM和10％ FBS DMEM兩種不同培養(yǎng)條件下連續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)，定量檢測(cè)黏附細(xì)胞總數(shù)；分別對(duì)連續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)、2小時(shí)和24小時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行掃描電鏡觀察及細(xì)胞面積定量分析；連續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)和24小時(shí)后，細(xì)胞骨架蛋白染色，激光共聚焦顯微鏡觀察；全血清孵育聚合膜24小時(shí)，定量檢測(cè)材料表面吸附的血清蛋白。
　　 結(jié)果：對(duì)四組改性基團(tuán)比

10、例不同的MPEG-PLLA-PLL聚合膜黏附細(xì)胞定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與PLLA比較，在DMEM和10％ FBS DMEM兩種培養(yǎng)條件下，四組聚合膜中MPEG-PLLA-PLL聚合膜細(xì)胞黏附量增高；同組聚合膜內(nèi)，細(xì)胞黏附量均隨著PLL含量的升高而增高，當(dāng)PLL增高至一定程度時(shí)，細(xì)胞黏附量下降。與TCP比較，在兩種培養(yǎng)條件下，MPEG17PLLA94PLL107和MPEG17PLLA160PLL162聚合膜組份細(xì)胞黏附量均高于TCP。
　　

11、 掃描電鏡結(jié)果顯示，MPEG-PLLA-PLL聚合膜和TCP表面，細(xì)胞扁平舒展，大量膜狀扁平偽足從細(xì)胞邊緣伸出，PLLA聚合膜上細(xì)胞呈球形，大量細(xì)長(zhǎng)指突狀偽足從細(xì)胞邊緣伸出。面積定量分析結(jié)果表明，MPEG-PLLA-PLL聚合膜和TCP上細(xì)胞舒展面積大于PLLA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上細(xì)胞面積的變化與PLLA比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果顯示，細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)，MP

12、EG-PLLA-PLL聚合膜和TCP表向細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)豐富，排列清晰；PLLA聚合膜表面細(xì)胞骨架蛋白呈環(huán)狀或點(diǎn)狀，不均勻分布于細(xì)胞邊緣及胞漿中；連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，MPEG-PLLA-PLL和TCP表面細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)豐富，排列清晰有序，大量骨架蛋白絲越過(guò)細(xì)胞核貫穿整個(gè)細(xì)胞；PLLA表面，骨架蛋白主要分布于細(xì)胞邊緣，表達(dá)稀疏。
　　 蛋白吸附定量分析結(jié)果顯示，與空白對(duì)照比較MPEG-PLLA-PLL聚合膜血清蛋白吸附量無(wú)明顯變化

13、，PLLA和MPEG-PLL兩種聚合膜上血清蛋白吸附量升高。
　　 結(jié)論：MPEG-PLLA-PLL聚合膜不受培養(yǎng)環(huán)境中血清的影響，能促進(jìn)BMSCs的黏附；MPEG-PLLA-PLL聚合膜通過(guò)降低培養(yǎng)環(huán)境中非特異性蛋白的吸附促進(jìn)BMSCs的黏附。
　　 第三章 MPEG-PLLA-PLL聚合膜細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
　　 目的：通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞在聚合膜表面生長(zhǎng)情況的觀察及細(xì)胞膜完整性的檢測(cè)，探討聚合膜體外細(xì)胞毒性。
　

14、　 方法：取第6-8代體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，接種至PLLA、MPEG-PLLA、MPEG-PLLA-PLL、MPEG-PLLA-PLL+Br等聚合膜和TCP表面，連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH的濃度，判斷細(xì)胞膜的完整性；連續(xù)培養(yǎng)3天和7天，對(duì)聚合膜表面的成骨細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫染色，倒置相差顯微鏡觀察。
　　 結(jié)果：LDH檢測(cè)結(jié)果顯示，PLLA、MPEG-PLLA和MPEG-PLLA-PLL聚合膜細(xì)胞培養(yǎng)上清與TCP比較，OD值

15、無(wú)明顯變化(p>0.05)；MPEG-PLLA-PLL+Br聚合膜細(xì)胞培養(yǎng)上清OD值明顯增高(p<0.05)。分別連續(xù)培養(yǎng)3天和7天，結(jié)晶紫染色顯示PLLA、MPEG-PLLA、PLLA-PLL、MPEG-PLLA-PLL聚合膜和TCP表面細(xì)胞大量生長(zhǎng)，MPEG-PLLA-PLL+Br聚合膜僅殘留細(xì)胞殘片。
　　 結(jié)論：經(jīng)過(guò)對(duì)PLLA，MPEG-PLLA，PLLA-PLL和MPEG-PLLA-PLL聚合膜體外實(shí)驗(yàn)未顯示聚合膜細(xì)胞

16、毒性。
　　 第四章BMSCs與MPEG-PLLA-PLL聚合膜黏附機(jī)制基因分析
　　 目的：通過(guò)對(duì)BMSCs與MPEG-PLLA-PLL聚合膜黏附過(guò)程中，相關(guān)黏附基因表達(dá)分析，探討MPEG-PLLA-PLL聚合膜對(duì)BMSCs黏附過(guò)程中的影響機(jī)制。
　　 方法：取第2-4代原代培養(yǎng)BMSCs，接種至PLLA、MPEG17-PLLA94和MPEG17-PLLA94-PLL107聚合膜和TCP表面連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，收

17、集各聚合膜和TCP上黏附的細(xì)胞，提取總RNA，利用SuperArray RT2 PCR試劑盒，采用Reversetranscription PCR及Realtime PCR技術(shù)，對(duì)與細(xì)胞初始黏附相關(guān)的84個(gè)黏附基因的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果：通過(guò)對(duì)MPEG-PLLA-PLL/PLLA、 MPEG-PLLA-PLL/TCP、MPEG-PLLA/PLLA、MPEG-PLLA/TCP、MPEG-PLLA/MPEG-PLLA-

18、PLLA、PLLA/TCP每?jī)煞N材料表面細(xì)胞黏附基因表達(dá)進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，共有26個(gè)基因改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與PLLA聚合膜和TCP比較，MPEG-PLLA-PLL聚合膜表面10個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2個(gè)基因表達(dá)下調(diào)：與MPEG-PLL聚合膜比較，MPEG-PLLA-PLL聚合膜表面6個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。變化活躍的基因有CDH1、COL16A1、ITGB2、ITGAL、ITGAM、LAMA1、LAMA3、MMP3、MMP7、MMP