骨髓基質(zhì)干細胞誘導內(nèi)皮細胞與自體骨髓基質(zhì)干細胞低氧條件下聯(lián)合培養(yǎng)后的成骨能力特性.pdf

1、目的： 自兔骨髓中分離獲取高純度的骨髓基質(zhì)干細胞（Bone Marrow Stromal Cells，BMSC）并對其進行體外培養(yǎng)、擴增；將部分BMSC向內(nèi)皮細胞（Endothelial Cells，EC）誘導，并鑒別其表型；觀察低氧條件下BMSC及其來源的EC聯(lián)合培養(yǎng)后，BMSC的增殖情況及體外成骨能力，探討低氧條件下BMSC與其來源的EC聯(lián)合培養(yǎng)對其體外成骨能力的影響。 方法： 1.兔骨髓基質(zhì)干細胞（BMSC

2、）的分離、培養(yǎng) 利用Percoll分離液（相對密度1.077）進行密度梯度離心法從兔骨髓中分離骨髓基質(zhì)干細胞，進行體外培養(yǎng)擴增。 2.骨髓基質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞的誘導分化、培養(yǎng)和鑒定 采用細胞性狀穩(wěn)定的第二代骨髓基質(zhì)干細胞消化，吹打均勻，更換培養(yǎng)液為內(nèi)皮誘導培養(yǎng)液，兩三天換液持續(xù)誘導，消化傳代后，取細胞做CD34免疫細胞化學鑒定其內(nèi)皮細胞表型。 3.MTT法檢測低氧條件下BMSC與其誘導來源的EC聯(lián)合培養(yǎng)的

3、細胞增殖及活力 取第二代骨髓基質(zhì)干細胞與其誘導來源的內(nèi)皮細胞，實驗分四組：（1）BMSC常氧培養(yǎng)組；（2）BMSC低氧培養(yǎng)組；（3）BMSC+EC常氧聯(lián)合培養(yǎng)組；（4）BMSC+EC低氧聯(lián)合培養(yǎng)組。體外連續(xù)培養(yǎng)7天，分別在此7天內(nèi)用MTT檢測各組細胞的增殖能力，酶標儀測定光密度值（OD值），每個樣本設(shè)六個復孔，求其平均值并繪制細胞生長曲線。 4.檢測低氧條件下BMSC與其誘導來源的EC聯(lián)合培養(yǎng)的成骨能力 取第三代

4、骨髓基質(zhì)干細胞與其誘導來源的內(nèi)皮細胞，實驗分四組：（1）BMSC常氧成骨誘導培養(yǎng)組；（2）BMSC低氧成骨誘導培養(yǎng)組；（3）BMSC+EC常氧成骨誘導聯(lián)合培養(yǎng)組：（4）BMSC+EC低氧成骨誘導聯(lián)合培養(yǎng)組。96孔板內(nèi)體外連續(xù)誘導培養(yǎng)6天，分別在此6天內(nèi)用PNPP法檢測各組細胞的堿性磷酸酶（ALP）活性的表達，酶標儀測定光密度值（OD值），每個樣本設(shè)五個復孔，求其平均值，并繪制ALP活性增長曲線；6孔板內(nèi)四組樣本體外連續(xù)誘導培養(yǎng)7天，在第

5、7天行茜素紅染色，觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。 結(jié)果： 1.密度梯度離心結(jié)合貼壁獲取高純度的BMSC，且較好保持了細胞的活性，貼壁3天后細胞成長梭形及多角形，五六天后增殖迅速，形成細胞集落。傳代后細胞形態(tài)更加單一，五六天后即可鋪滿瓶底。 2.由BMSC誘導來源的原代EC培養(yǎng)三天后，細胞貼壁，五天后明顯集落形成，細胞成梭形：傳代后，細胞逐漸變大，由長梭形變?yōu)槎嘟切?，成典型的“鋪路石”樣?nèi)皮細胞形態(tài)。傳代后的內(nèi)皮細胞CD3

6、4免疫細胞化學染色為陽性。 3.MTT法檢測各組細胞增殖及活力顯示：第一、二天各組細胞數(shù)量無明顯增加且統(tǒng)計學上各組間細胞增殖能力沒有顯著性差異（P>0.05）；第三天后，各組細胞數(shù)量顯著增加，統(tǒng)計學上低氧培養(yǎng)組的細胞增殖能力均明顯高于常氧培養(yǎng)組（P<0.01），但同條件下的BMSC單獨培養(yǎng)組和BMSC+EC聯(lián)合培養(yǎng)組間的細胞增殖能力沒有顯著性差異（P>0.05）。 4.PNPP法檢測各組ALP活性表達顯示：BMSC+EC

7、低氧成骨誘導聯(lián)合培養(yǎng)組的ALP活性表達明顯高于其他三組（P<0.05）；BMSC低氧成骨誘導培養(yǎng)組高于BMSC常氧成骨誘導培養(yǎng)組（P<0.05）；BMSC+EC常氧成骨誘導聯(lián)合培養(yǎng)組高于BMSC常氧成骨誘導培養(yǎng)組（P<0.05）；四組樣本培養(yǎng)七天后，BMSC+EC低氧成骨誘導聯(lián)合培養(yǎng)組部分細胞密集生長區(qū)有礦化結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色呈橘紅色，其他三組未見。 結(jié)論： 1.BMSC可通過密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)獲得。在一定的體外