抗血管新生DNA疫苗Flk-1-,ECD--C3d3的制備及其抗膀胱腫瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腫瘤的形成、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移均有賴于血流提供養(yǎng)分，新生血管化的強(qiáng)度限制/決定了腫瘤生長(zhǎng)速度。因此，抗血管新生被認(rèn)為是惡性腫瘤極有力的治療手段。自JudahFolkman1971年在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上發(fā)表題為《Tumoranagiogensis：Therapeuticimplications》的、具有開(kāi)創(chuàng)性意義的文章以來(lái)，經(jīng)過(guò)近四十年的發(fā)展，關(guān)于腫瘤血管新生及抗血管新生治療的研究取得了令人矚目的成果，大量研究表明這種治療方法具有“兩高

2、(高靶向性、高作用效率)、兩低(低副反應(yīng)、低耐藥比例)”的特點(diǎn)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的效果，但應(yīng)用于人體后療效卻不盡如人意，主要問(wèn)題是由于藥物分子代謝特性等限制，常需大量、長(zhǎng)期給藥，副反應(yīng)大為增加；此外，目前也缺少相對(duì)成熟的治療方案和療效評(píng)估體系。 相比之下，激發(fā)機(jī)體針對(duì)腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性主動(dòng)免疫反應(yīng)，則可形成直接的殺傷效應(yīng)，從而抑制和破壞新生血管的形成，具有作用持久、效率高、避開(kāi)了腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制效應(yīng)等優(yōu)勢(shì)。

3、實(shí)現(xiàn)這一方案首先需選擇腫瘤和正常內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)有明顯差異、免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別的靶抗原。Flk-1(即血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2，vascularendothelialcellgrowthfactorreceptor-2，VEGFR-2)在成人正常內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)極低，多數(shù)組織中檢測(cè)不到，而在血管新生過(guò)程中增殖的內(nèi)皮細(xì)胞上則高度表達(dá)，是目前公認(rèn)的腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞較好的分子標(biāo)志和靶抗原。但Flk-1屬自身抗原，研究人員面臨如何才能增強(qiáng)其免疫原性，打破

4、免疫耐受激發(fā)有效免疫應(yīng)答的難題。上個(gè)世紀(jì)90年代后期發(fā)現(xiàn)2-3個(gè)串聯(lián)的補(bǔ)體C3裂解片段C3d具有強(qiáng)烈的免疫佐劑效應(yīng)，可大大提高抗原的免疫原性，為克服這一障礙提供了有力的工具。本研究利用了補(bǔ)體領(lǐng)域的這一重要發(fā)現(xiàn)，引入C3d作為分子內(nèi)佐劑，制備了含有Flk-1胞外段265bp-2493bp(Flk-1extracellulardomain，F(xiàn)lk-1ECD)和串聯(lián)的3個(gè)C3d(C3d3)融合基因的DNA疫苗，并利用動(dòng)物模型初步觀察了該疫苗對(duì)

5、膀胱腫瘤生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)，為開(kāi)發(fā)安全、有效的腫瘤抗血管新生疫苗打下了基礎(chǔ)。主要的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： 第一部分真核表達(dá)質(zhì)粒pSG.SS.Flk-1ECD.C3d3.YL及pSG.SS.Flk-1ECD.YL的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：構(gòu)建可作為DNA疫苗免疫接種的真核表達(dá)質(zhì)粒pSG.SS.Flk-1ECD.C3d3.YL及pSG.SS.Flk-1ECD.YL。 1.以質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Flk-1為模板，PCR擴(kuò)增編

6、碼Flk-1胞外段(extracellulardomain，ECD)265bp-2493bp，并在兩端添加了限制性內(nèi)切酶BglⅡ和BamHⅠ識(shí)別序列的DNA片段，將該片段連入中間載體質(zhì)粒pMDT-18得到pMDT-18-Flk-1ECD，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BglⅡ和BamHⅠ雙酶切后，產(chǎn)物通過(guò)同樣的內(nèi)切酶位點(diǎn)定向克隆入已插入和未插入C3d3序列的真核表達(dá)質(zhì)粒pSG.SS.C3d3.YL及pSG.SS.YL，N端與信號(hào)肽SS相連，C端與C3d

7、3或YL標(biāo)簽相連，構(gòu)建可作為DNA疫苗免疫接種的真核表達(dá)質(zhì)粒pSG.SS.Flk-1ECD.C3d3.YL和pSG.SS.Flk-1ECD.YL，經(jīng)酶切及測(cè)序證實(shí)兩種質(zhì)粒符合設(shè)計(jì)要求。 2.將pSG.SS.Flk-1ECD.C3d3.YL、pSG.SS.Flk-1ECD.YL和pSG.SS.YL轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后對(duì)表達(dá)的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：(1)對(duì)pSG.SS.Flk-1ECD.C3d3.YL、pSG.SS.F

8、lk-1ECD.YL及pSG.SS.YL轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行Westernblot鑒定，結(jié)果顯示前兩者有分子量分別為191kD及81kD的蛋白表達(dá)，與Flk-1ECD-C3d3融合蛋白及Flk-1ECD蛋白的理論分子量相似；后者無(wú)可與單抗結(jié)合的蛋白產(chǎn)物表達(dá)。(2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Flk-1表達(dá)，pSG.SS.Flk-1ECD.C3d3.YL、pSG.SS.Flk-1ECD.YL轉(zhuǎn)染細(xì)胞為陽(yáng)性，而pSG.SS.YL則為陰性

9、。(3)Raji細(xì)胞膜表達(dá)豐富的C3d受體(CD21)，把其與不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清共孵育，間接免疫熒光法標(biāo)記后流式細(xì)胞儀檢測(cè)Raji細(xì)胞表面Flk-1ECD抗原存在情況，結(jié)果顯示與pSG.SS.Flk-1ECD.C3d3.YL轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清共孵育的Raji細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞比例高達(dá)75.9％，而與pSG.SS.Flk-1ECD.YL和pSG.SS.YL轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清共孵育者及對(duì)照分別僅為4.9％、4.5％及4.8％。 以上結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)

10、構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSG.SS.Flk-1ECD.C3d3.YL和pSG.SS.Flk-1ECD.YL能在真核細(xì)胞表達(dá)Flk-1ECD與C3d3的融合蛋白和Flk-1ECD蛋白，且Flk-1ECD并未因其后串聯(lián)了C3d3而影響特異性單抗識(shí)對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，C3d3也未因與Flk-1ECD的耦聯(lián)而喪失與受體結(jié)合的生物學(xué)活性。 第二部份Flk-1ECD-C3d3DNA疫苗的免疫效應(yīng) 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA疫苗Flk-1ECD

11、-C3d3(即質(zhì)粒pSG.SS.Flk-1ECD.C3d3.YL)和Flk-1ECD(即質(zhì)粒pSG.SS.Flk-1ECD.YL)的免疫效應(yīng)進(jìn)行初步研究，以檢驗(yàn)C3d3的連接是否能有效增強(qiáng)Flk-1ECD免疫原性，誘導(dǎo)更強(qiáng)的Flk-1特異性免疫應(yīng)答。 1.BALB/c小鼠48只，隨機(jī)分4組，12只/組，分別肌肉注射接種Flk-1ECD-C3d3、Flk-1ECD、pSG.SS.YL和PBS，每次100pmol/100ul，初免及

12、加強(qiáng)共3次，1次/2周。每組動(dòng)物取6只于首次免疫同時(shí)、首次免疫后2、4、5、6、7、8、10、12周斷尾取血測(cè)定血清抗Flk-1抗體效價(jià)，另外6只于末次免疫后1周自下腔靜脈取血測(cè)定免疫血清對(duì)表達(dá)Flk-1的靶細(xì)胞的殺傷作用，取脾臟分離脾細(xì)胞測(cè)定Flk-1抗原刺激脾淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)及CTL對(duì)靶細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)。 2.小鼠取脾臟分離淋巴細(xì)胞后，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：(1)MTT法測(cè)定Flk-1抗原刺激后的增殖情況，可見(jiàn)刺激指數(shù)(SI)F

13、lk-1ECD-C3d3組顯著高于其它三組(P均＜0.01)，F(xiàn)lk-1ECD組則與PBS組相比有顯著性差異(P＜0.05)；(2)通過(guò)組織培養(yǎng)法獲得肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為隨后進(jìn)行的殺傷實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液和涂片，經(jīng)間接免疫熒光染色CD31、Flk-1抗原，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示CD31和Flk-1陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為88.5％和86.8％，涂片可見(jiàn)黃綠色熒光，證明可用于殺傷實(shí)驗(yàn)；(3)采用乳酸脫氫酶釋放法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞在Flk-

14、1抗原刺激后作為效應(yīng)細(xì)胞對(duì)表達(dá)Flk-1靶細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果顯示接種Flk-1ECD-C3d3的小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性CTL活性顯著高于其它三組(P均＜0.01)。 3.ELISA測(cè)定血清抗Flk-1抗體效價(jià)，可見(jiàn)接種Flk-1ECD-C3d3比接種Flk-1ECD的動(dòng)物抗體出現(xiàn)早2周，效價(jià)峰值均出現(xiàn)在5周(3840vs60)，前者12周時(shí)仍高達(dá)960，后者10周時(shí)抗體已消失。pSG.SS.YL和PBS則始終為陰性。采用與脾細(xì)胞

15、CTL效應(yīng)測(cè)定相同的方法，測(cè)定免疫血清對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果顯示接種Flk-1ECD-C3d3的小鼠免疫血清在不同稀釋倍數(shù)下均能有效殺傷靶細(xì)胞，殺傷率顯著高于其它三組小鼠(P均＜0.01)。 以上結(jié)果表明接種Flk-1ECD-C3d3誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平顯著高于Flk-1ECD，F(xiàn)lk-1ECD雖也誘發(fā)了一定程度的免疫反應(yīng)，但不足以形成對(duì)靶細(xì)胞的有效殺傷；C3d3的耦聯(lián)有效增強(qiáng)了Flk-1的免疫原性，打破了機(jī)體免疫耐受，激發(fā)了較

16、強(qiáng)的針對(duì)Flk-1的特異性免疫應(yīng)答。 第三部份Flk-1ECD-C3d3DNA疫苗對(duì)小鼠膀胱腫瘤的抑制效應(yīng) 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：利用皮下荷瘤的小鼠膀胱腫瘤模型，對(duì)Flk-1ECD-C3d3DNA疫苗在體內(nèi)的抗血管新生效應(yīng)和對(duì)腫瘤的抑制作用進(jìn)行檢驗(yàn)。 綜上所述，本研究成功構(gòu)建了Flk-1ECD-C3d3DNA疫苗，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)Flk-1的主動(dòng)免疫反應(yīng)，有效殺傷增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞，在皮下荷瘤的小鼠膀胱腫瘤模型中體現(xiàn)出良好