hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的體液免疫效應(yīng)及其抗生育潛能.pdf

1、目的:構(gòu)建帶有6個(gè)組氨酸(6His)純化標(biāo)簽的hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒,體外穩(wěn)定表達(dá)與純化具有生物學(xué)活性的hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白.通過(guò)融合分子佐劑C3d3,增強(qiáng)hCGβ蛋白抗原在不同品系小鼠的免疫原性,實(shí)現(xiàn)hCGβ蛋白疫苗的Th2型體液免疫優(yōu)勢(shì)效應(yīng),并增強(qiáng)hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗抗血清中和hCG生物學(xué)活性的能力.方法:以帶有信號(hào)肽的hCGβ為模板,經(jīng)PCR反應(yīng)在hCGβ的氨基端

2、加上6個(gè)組氨酸(6His)純化標(biāo)簽,將其構(gòu)建入高效真核表達(dá)載體phCMV1即得phCMV1-6His-hCGβ.將C3d3與hCGβ進(jìn)行基因融合,并構(gòu)建入phCMV1即得phCMV1-6His-hCGβ-C3d3.脂質(zhì)體法介導(dǎo)phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ、pcDNA3-hCGβ-C3d3和pcDNA3-hCGβ轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞,G418(800μg/ml)篩選抗藥性克隆.放射

3、免疫法檢測(cè)抗性克隆無(wú)血清培液中hCGβ表達(dá)量,Western blotting鑒定所表達(dá)的重組蛋白,Raji細(xì)胞免疫化學(xué)染色法鑒定hCGβ是否與C3d分子成功融合.隨后,采用針對(duì)于6His的鎳柱結(jié)合凝膠過(guò)濾層析純化表達(dá)產(chǎn)物.分別用hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ蛋白和hCGβ蛋白加用弗氏佐劑免疫生育期雌性BALB/c和C<,57>BL/6小鼠,共免疫兩次,間隔4周.ELISA測(cè)定血清中抗hCGβ抗體滴度,比較各組的免疫效果.BA

4、LB/c小鼠于末次免疫后3周處死,制備脾淋巴細(xì)胞懸液hCG體外脈沖培養(yǎng)48h,ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中Thl型(IFN<,γ>、IL-2)和Th2型(IL-4、IL-10)細(xì)胞因子分泌水平.為檢測(cè)hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的抗生育潛能,把hCG分別與正常鼠血清、hCGβ-C3d3免疫鼠血清、hCGβ免疫鼠血清和hCGβ+CFA/IFA免疫鼠血清共培養(yǎng)MLTC-1細(xì)胞,化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)培養(yǎng)前及共培養(yǎng)7小時(shí)后培養(yǎng)上清中孕酮的含量.此外,選

5、用3周齡雌性BALB/c小鼠,皮下注射hCG的同時(shí)分別腹腔內(nèi)注射系列稀釋的正常鼠血清、hCGβ-C3d3免疫鼠血清、hCGβ免疫鼠血清和hCGβ+CFA/IFA免疫鼠血清,每天2次,共3天.3天后取子宮稱(chēng)濕重,計(jì)算每克體重的子宮濕重(mg/g).結(jié)論:成功構(gòu)建了hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ.在CHO細(xì)胞中可成功獲得hCGβ-C3d3融合