hCGβ-CTP多聚體-3C3d融合蛋白在巴氏畢赤酵母中的表達(dá)及產(chǎn)物純化.pdf

1、人絨毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin，hCG)是由胎盤(pán)滋養(yǎng)層合體細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白激素，在早期妊娠中起促進(jìn)胚泡發(fā)育、維持妊娠的作用。因此，hCG疫苗最初作為一種理想的避孕疫苗而受到人們的重視。近年來(lái)的研究表明，絕大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞能表達(dá)hCG類(lèi)分子，并隨著腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步增殖擴(kuò)散，其hCG的表達(dá)量會(huì)不斷增加，在腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最高值。研究表明，hCG在細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤血管生成、腫瘤

2、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸中起重要作用。因此，hCG疫苗還可以用于惡性腫瘤的治療。 hCG與TSH(促甲狀腺激素)、FSH(促卵泡激素)、LH(黃體生成素)等同為糖蛋白激素家族，具有相同的Q亞基，其B亞基也與LH的β亞基有部分同源性，只有hCGB亞基羧基端109—145氨基酸殘基組成的37肽(CTP)是hCG分子所特有的，并含有hCG的特異表位，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體具有更好的抗原特異性。其不足之處是CTP的分子量小，抗原性較差，產(chǎn)生的抗體中和h

3、CG生物活性的能力低。我們?cè)ㄟ^(guò)基因重組的方法在畢赤酵母和大腸桿菌中成功地表達(dá)了CTP二聚體、三聚體、四聚體，并制備了相應(yīng)的多克隆抗體，證明了hCGB-CTP37多聚體產(chǎn)生的抗體滴度高于單體產(chǎn)生的抗體滴度。 為了進(jìn)一步提高h(yuǎn)CGB．CTP37疫苗的免疫原性并減少疫苗的制備工藝，我們利用基因工程的方法在重組的hCGβ-CTP37多聚體的基因上連接了分子佐劑C3d基因的三聚體，并在其5’端連接了純化標(biāo)簽6his基因，構(gòu)建了hCGβ-

4、(CTP)n(n=3，4)、hCGβ-(CTP)n(n=3，4)．3C3d四種重組蛋白的基因，然后克隆入載體pPIC9K得到表達(dá)質(zhì)粒pPIC9Khis6(CTP)n(n=3，4)和pPIC9Khis6(CTP)n(n=3，4)3C3d，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定及DNA測(cè)序確認(rèn)序列及讀碼框正確后，電轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞GS115。利用不同濃度的G418對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，以得到含高拷貝目的基因的克隆?？寺〗?jīng)PCR鑒定后在甲醇誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。Weste

5、mblot分析結(jié)果表明成功表達(dá)了融合蛋白hCGp．(CTP)3、hCGβ-(CTP)4、hCGp．(CTP)3．3C3d、hCGp-(CTP)4-3C3d，其分子量分別為32kD、40kD、125kD和138kD左右。實(shí)際分子量與理論分子量相符。 蛋白純化一直是蛋白表達(dá)領(lǐng)域的難點(diǎn)問(wèn)題。我們對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了一系列純化方法的探索，并初步確立了有效的純化步驟。我們依次使用了鹽析、凝膠過(guò)濾和離子交換的方法對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行了純化，獲得