bFGF單抗抗血管新生及抗腫瘤作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth fator,bFGF)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中的一員,它作為一種廣泛的有絲分裂原,可通過自分泌或旁分泌的方式促進(jìn)多種細(xì)胞,包括腫瘤細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化。FGF家族成員主要通過與其高親和力受體的結(jié)合向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào),發(fā)揮其生物學(xué)活性。高親和力受體又稱受體酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase,RTKs)

2、,存在FGFR1,FGFR2,FGFR3,FGFR4四種蛋白。bFGF除不與FGFR2b結(jié)合外可與其他幾類FGFR亞型包括FGFR1b,FGFR1c,FGFR2c,FGFR3b,FGFR3c,FGR4結(jié)合。其中FGFR-1是bFGF的主要受體,高表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞表面,bFGF與其結(jié)合后,FGFR通過二聚化而發(fā)生自身磷酸化,活化的FGFR可招募一些接頭蛋白,從而激活下游的信號(hào)通路,包括MAPKs/ERKs,PI3K/AKT

3、,PLCγ/PKC等,后者又活化轉(zhuǎn)錄因子及與細(xì)胞周期,凋亡/抗凋亡,細(xì)胞骨架等相關(guān)的蛋白,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)活性。bFGF及FGFR高表達(dá)于包括黑色素瘤,肺癌在內(nèi)的多種腫瘤組織,且與腫瘤的轉(zhuǎn)移、分期、預(yù)后相關(guān),bFGF/FGFR系統(tǒng)成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。
　　 血管新生過程是從已存在血管中長(zhǎng)出新血管的過程。腫瘤血管新生不僅為腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng),更是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的物質(zhì)基礎(chǔ)。腫瘤血管新生的過程包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖,內(nèi)皮干細(xì)胞的遷移,內(nèi)

4、皮細(xì)胞的遷移和侵入,內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,內(nèi)皮細(xì)胞在管狀結(jié)構(gòu)中的組織,循環(huán)系統(tǒng)的形成,血管的成熟,血管的退化等。bFGF作為重要的促血管新生因子在血管新生過程的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。
　　 黑色素瘤是皮膚癌中最致命的一種,近年來(lái)在西方國(guó)家其發(fā)病率和死亡率持續(xù)增加。肺癌在我國(guó)及世界許多國(guó)家高發(fā),且成為癌癥的第一殺手。黑色素瘤對(duì)放化療藥物中度敏感,且容易產(chǎn)生耐藥,黑素素瘤的耐藥性及其高轉(zhuǎn)移率是導(dǎo)致其很難治愈的重要因?yàn)?。因此新的治療手段尤其是?/p>

5、向生物療法備受關(guān)注。bFGF及FGFR在黑色素瘤組織中高表達(dá),與其轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān),有學(xué)者甚至認(rèn)為病人血清及組織中bFGF的水平可作為腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)。bFGF可通過自分泌的方式促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞及肺癌細(xì)胞的增殖。正常黑素細(xì)胞不表達(dá)bFGF,然而其體外培養(yǎng)則必須有外源性bFGF的加入,而且將bFGF基因轉(zhuǎn)入正常黑素細(xì)胞使其高表達(dá)bFGF,可出現(xiàn)類似于黑色素瘤早期的表型；除此之外bFGF還是具有抗凋亡作用,可抵抗饑惡及化療藥物誘導(dǎo)的靶細(xì)

6、胞凋亡。
　　 肺癌的發(fā)病率和死亡率在我國(guó)乃至世界許多國(guó)家居于首位,其高轉(zhuǎn)移率及對(duì)放化療藥物的耐藥是肺癌患者死亡的重要因?yàn)椤Ｇ夷壳皞鹘y(tǒng)的治療方法主要針對(duì)早期肺癌患者,對(duì)于晚期患者則難以治愈。因此近年來(lái)新的治療手段,尤其是靶向抗體治療備受關(guān)注。有研究表明bFGF在非小細(xì)胞系肺癌組織中表達(dá)率高于50％,且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期相關(guān),其在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及中晚期肺癌組織中的表達(dá)明顯高于早期。有研究證明bFGF是多種腫瘤的廣譜耐藥機(jī)制。bFG

7、F導(dǎo)致肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥的因?yàn)樵谟赽FGF僅能促進(jìn)肺痛細(xì)胞的增殖,還可使其逃避化療藥物誘導(dǎo)的凋亡。因此bFGF可能成為肺痛治療的良好的靶點(diǎn)。
　　 因此本研究以血管內(nèi)皮細(xì)胞,黑色素瘤細(xì)胞,肺癌細(xì)胞為研究對(duì)象研究bFGF單抗的體內(nèi)外抗血管新生,及抗腫瘤作用。
　　 方法
　　 1.bFGF單抗抗血管新生作用
　　 1)將本室保存的多株產(chǎn)生抗bFGF單抗的雜交瘤細(xì)胞克隆化后,擴(kuò)大培養(yǎng),注射福氏不完全佐劑處

8、理過的小鼠腹腔,制備腹水型單克隆抗體。蛋白G親和層析柱純化bFGF單抗,間接ELISA法檢測(cè)其與bFGF的結(jié)合活性及與aFGF、VEGF是否存在交叉反應(yīng)。另外將天然及巰基乙醇處理后熱失活的bFGF包板,用間接ELISA法檢測(cè)單抗識(shí)別抗原表位。只與天然bFGF反應(yīng),而不與熱失活的bFGF反應(yīng)的單抗識(shí)別的是bFGF的空間表位；相反可與二者都結(jié)合的bFGF單抗識(shí)別的bFGF的線性表位。
　　 2)將bFGF單抗與FGF高親和力受體FG

9、FR-1βⅢC混合后加入已包被有bFGF的ELISA板中,通過競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)bFGF單抗是否能夠抑制bFGF與其高親和力受體FGFR-1βⅢC的結(jié)合。如果能抑制說(shuō)明bFGF單抗識(shí)別bFGF受體結(jié)合相關(guān)區(qū)域。另外將bFGF單抗與肝素混合混合后加入已包被有bFGF的ELISA板中,通過競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)bFGF單抗是否能夠抑制bFGF與肝素的結(jié)合,如果抑制說(shuō)明bFGF單抗識(shí)別bFGF肝素結(jié)合相關(guān)區(qū)域。
　　 3)取原代臍靜脈

10、血管內(nèi)皮細(xì)胞以bFGF刺激其增殖,同時(shí)加入bFGF單抗,CCK-8法檢測(cè)此單抗對(duì)bFGF促進(jìn)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響；
　　 4)將血管內(nèi)皮細(xì)胞接種到已鋪上基質(zhì)膠的細(xì)胞培板中,加入bFGF及bFGF和單抗的混合物,培養(yǎng)2-5h后鏡下計(jì)數(shù)封閉的管狀結(jié)構(gòu),以檢測(cè)bFGF單抗對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞成管的影響；
　　 5)Transwell法檢測(cè)單抗對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響,將血管內(nèi)皮細(xì)胞加入transwell小室的上室中,下室加入含1

11、0ng/mlbFGF的M199完全培養(yǎng)基,誘導(dǎo)上室中血管內(nèi)皮細(xì)胞向下室的遷移,另外加入bFGF單抗檢測(cè)其對(duì)遷移的影響,20h后吉姆薩染色,擦去上層細(xì)胞計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)；
　　 6)96孔板中接種血管內(nèi)皮細(xì)胞,貼壁后加入bFGF單抗作用48h,收集黑色素瘤細(xì)胞,加入單抗處理過的血管內(nèi)皮細(xì)胞中,15min后洗板,光鏡下已粘附的黑色素瘤細(xì)胞數(shù),以檢測(cè)bFGF單抗對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與黑色素瘤細(xì)胞粘附的影響；
　　 7)取7日齡雞胚,

12、以牙科鉆開窗,暴露尿囊膜,以中速定性濾紙為載體加入bFGF和bFGF單抗,作用4天后,滴加等量甲醇和丙酮混合液以殺死雞胚并固定尿囊膜,15-20 min后,待CAM血管中的血液凝固后,剪取尿囊膜,放入水中展平,拍照,計(jì)數(shù)濾紙周圍呈放射狀排列的血管數(shù),檢測(cè)bFGF單抗的抗血管新生作用。
　　 2.bFGF單抗抗黑色瘤生長(zhǎng)作用
　　 1)收集B16和B16F10細(xì)胞,提取RNA,以RT-PCR法檢測(cè)B16和B16F10細(xì)胞表

13、達(dá)bFGF,FGFR及Glypican1,Glypican5,Syndecan1,Syndecan4情況。
　　 2)收集B16細(xì)胞,鋪板,加入bFGF單抗作用96h,CCK-8法檢測(cè)bFGF單抗對(duì)體外培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響；
　　 3)收集bFGF單抗處理和未處理的B16細(xì)胞,以AnnexinV/PI雙染,流式細(xì)胞儀檢測(cè)bFGF單抗誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的情況,AnnexinV+/PI-表示細(xì)胞發(fā)生早期凋亡,Ann

14、exinV+/PI+表示細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡,
　　 4)Transwell法檢測(cè)bFGF單抗對(duì)B16F10細(xì)胞遷移的影響,將B16F10細(xì)胞加入transwell小室的上室中,下室加入含RPMI1640完全培養(yǎng)基,誘導(dǎo)上室中黑色素細(xì)胞向下室的遷移,另外加入bFGF單抗檢測(cè)其對(duì)遷移的影響,20h后吉姆薩染色,擦去上層細(xì)胞計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù):
　　 5)使用C57 BL/6小鼠建立黑色素移植瘤小鼠,并檢測(cè)尾靜脈和瘤周皮下注射抗體

15、及不同給藥劑量對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)、瘤重及小鼠體重的影響。免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織CD31表達(dá)(微血管密度),TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織凋亡的情況,以初步探討bFGF單抗的抗腫瘤機(jī)制。
　　 6)以5中同樣的方法建立黑色素痛小鼠模型,持續(xù)給藥,直至小鼠死亡,記錄小鼠生存時(shí)間,繪制小鼠生存曲線,計(jì)算各組小鼠中位生存時(shí)間。
　　 3.bFGF單抗抗Lewis肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移作用
　　 使用C57 BL/6小鼠建立肺癌原位轉(zhuǎn)移

16、模型,瘤周皮下注射bFGF單抗,三天一次連續(xù)六次,并檢測(cè)其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、瘤重、及小鼠體重的影響；給藥六次后處死小鼠取完整雙肺,計(jì)數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù),并用HE染色肺組織確認(rèn)痛轉(zhuǎn)移灶。用免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織微血管密度,初步探討bFGF單抗抗腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制。
　　 結(jié)論
　　 1.三株單抗MabF7,MabF10,MabF12均能抑制bFGF與FGFR1的結(jié)合。三株單抗均可一定程度的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,遷移及成管過程,但雞

17、胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)則顯示,只有MabF7和MabF12具有顯著的抑制尿囊膜血管新生作用,提示bFGF單抗可用于抗血管新生作用。
　　 2.以黑色素瘤為模型探討bFGF單抗對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用,發(fā)現(xiàn)三株單抗均可抑制黑色素瘤的生長(zhǎng),并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。但通過建立C57 BL/6小鼠黑色素抑制瘤模型研究其體內(nèi)抗腫瘤效果則發(fā)現(xiàn),只有MabF7具有顯著的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。MabF7對(duì)體內(nèi)黑色素瘤生長(zhǎng)的抑制作用可能與其誘導(dǎo)腫瘤凋亡及降低微血管密度有關(guān)