抑胃多肽疫苗的構(gòu)建及主動(dòng)免疫后對(duì)大鼠行為學(xué)和腦功能的影響.pdf

1、抑胃多肽(gastric inhibitory peptide；又稱葡萄糖依賴性促胰島素分泌多肽，glucose-dependent insulinotropic polypeptide；GIP)是由分布于十二指腸和空腸的K細(xì)胞分泌的一種含42個(gè)氨基酸的直鏈多肽。血液中GIP的濃度與飲食成份密切相關(guān)，進(jìn)餐的質(zhì)與量決定了餐后GIP分泌的高低。葡萄糖、脂肪或氨基酸的攝入，均可促使GIP釋放，其中高脂飲食會(huì)明顯增加GIP的分泌；而低脂飲食，則

2、GIP的分泌量偏低。GIP是一種較為重要的調(diào)控糖脂代謝的腸促胰島素(incretin)。GIP通過(guò)與其七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體(GIPR)結(jié)合，發(fā)揮著調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化成熟；調(diào)控脂肪細(xì)胞的脂解及再酯化；增加脂蛋白酯酶(LPL)的合成、分泌及活性，從而促進(jìn)甘油三酯(TG)的貯存；以及促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖(G)的攝取等作用。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，GIP可能是過(guò)剩營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致肥胖一個(gè)關(guān)鍵激素。在動(dòng)物試驗(yàn)中，采用GIP受體基因敲除鼠、GIP受體拮抗劑

3、、減少小腸K細(xì)胞GIP的分泌等方法，均能有效抑制脂肪合成、控制肥胖、減少體重增加等。因此，阻斷或削弱GIP生物活性的方法可能是今后肥胖藥物治療的又一新靶點(diǎn)，干擾GIP/GIPR信號(hào)通路在抗肥胖治療方面具有潛在研究前景。
　　 基因工程疫苗領(lǐng)域的快速發(fā)展為抗肥胖領(lǐng)域研究提供了另一種可能的藥物治療策略。采用疫苗免疫獲得抗體，中和自身內(nèi)源性的GIP的方法，為戰(zhàn)勝肥胖及其相關(guān)并發(fā)癥帶來(lái)了新希望。目前已有研究者以噬菌體-病毒樣顆粒(Qβ-

4、VLP)或卵清蛋白(ovalbumin)為載體，分別與GIP1-15位多肽序列或GIP1-11位多肽序列，采用化學(xué)耦聯(lián)方式結(jié)合，構(gòu)建蛋白疫苗，在小鼠模型上進(jìn)行了抗肥胖相關(guān)研究，兩種疫苗形式均能使小鼠打破免疫耐受，產(chǎn)生針對(duì)GIP的特異性抗體，從而獲得了抗肥胖或改善血糖的作用。疫苗治療的主要優(yōu)勢(shì)在于其僅需短期治療，卻可獲得長(zhǎng)期收益，從而使患者依從性問(wèn)題得到很好的解決。但這一點(diǎn)也使得疫苗的免疫治療存在一定潛在風(fēng)險(xiǎn)，免疫治療產(chǎn)生的抗體后會(huì)在較長(zhǎng)

5、時(shí)間內(nèi)持續(xù)發(fā)揮效應(yīng)，如一旦產(chǎn)生不良作用，短期之內(nèi)則難以祛除，因此GIP靶向的免疫治療在應(yīng)用前尚需在更多動(dòng)物模型上進(jìn)行研究比較，并給與相對(duì)綜合及長(zhǎng)期地觀察和評(píng)價(jià)。目前認(rèn)為GIP/GIPR信號(hào)通路除調(diào)控能量代謝外，尚維系著機(jī)體的其他方面的很多重要功能。有研究發(fā)現(xiàn)GIPR在腦組織中廣泛表達(dá)，同時(shí)GIP具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖，減少有害物質(zhì)神經(jīng)元損傷的作用。因此，從一定程度上推斷，GIP可能具有調(diào)控機(jī)體行為和腦功能的作用。已有實(shí)驗(yàn)證

6、實(shí)GIP過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力、認(rèn)知記憶能力明顯提升，說(shuō)明高水平的GIP會(huì)引起行為學(xué)的改變。那么，通過(guò)免疫的方法改變血循環(huán)中的GIP水平，是否會(huì)對(duì)行為學(xué)及腦功能帶來(lái)影響，目前尚無(wú)關(guān)于這方面的相關(guān)研究和報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)采用構(gòu)建GIP疫苗，主動(dòng)免疫大鼠的方法，觀察免疫治療影響GIP/GIPR信號(hào)通路后對(duì)大鼠體重、行為學(xué)及腦功能發(fā)面的影響。
　　 目的：以乙肝核心抗原-病毒樣顆粒(HBc-VLP)或鑰孔戚血藍(lán)蛋白(KLH

7、)為載體分別構(gòu)建攜帶GIP序列的蛋白疫苗HBc-GIP及GIP-KLH，主動(dòng)免疫高脂飲食大鼠，觀察疫苗免疫效果；高脂飲食大鼠主動(dòng)免疫GLP-KLH蛋白疫苗后，觀察其在體重、行為學(xué)以及腦功能方面的變化。初步探討以GIP為靶向的免疫干預(yù)治療的可行性及安全性問(wèn)題，為肥胖的免疫治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：克隆GIP N端12肽的編碼cDNA序列，并與HBc VLP(1-144a.a.)cDNA序列進(jìn)行融合，通過(guò)原核表達(dá)及純化，

8、制備攜帶GIP序列的HBc VLP疫苗(HBc-GIP)；采用固相合成方法合成GIP成熟體多肽N端1-12序列，并將其C端與KLH耦聯(lián)構(gòu)建GIP蛋白疫苗(GIP-KLH)；免疫高脂飲食大鼠并進(jìn)行免疫學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)。通過(guò)對(duì)高脂飲食大鼠的體重稱量、行為學(xué)試驗(yàn)(開(kāi)放場(chǎng)測(cè)試及Morris水迷宮測(cè)試)、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像儀(PET/CT)檢測(cè)腦糖利用率、TUNEL及PCNA的方法檢測(cè)海馬齒狀回細(xì)胞的增殖和凋亡情況來(lái)評(píng)估GIP-KLH疫苗免疫組與

9、對(duì)照組(如期皮下多點(diǎn)注射KLH)在體重、行為學(xué)及腦功能方面存在的差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功制備了攜帶GIP抗原序列的HBc-GIP蛋白疫苗，并同時(shí)制備了編碼該融合蛋白序列的核酸疫苗pVAX1-HBc-GIP。兩種疫苗分別免疫或聯(lián)合免疫高脂飲食大鼠后，均可以產(chǎn)生GIP特異性抗體，而做為對(duì)照的HBc免疫組和PBS免疫組則沒(méi)有GIP特異性抗體的產(chǎn)生。說(shuō)明我們制備的GIP核酸疫苗及蛋白疫苗均能夠打破宿主對(duì)自身GIP的免

10、疫耐受而產(chǎn)生抗體。在免疫策略組合上，我們發(fā)現(xiàn)兩次免疫GIP核酸疫苗后再兩次免疫HBc-GIP蛋白疫苗的策略(pV-HBc-GIP*2+HBc-GIP*2)可以有效地誘導(dǎo)高滴度GIP抗體，其抗體滴度在第3輪免疫后開(kāi)始顯著提高，并在第4輪加強(qiáng)免疫后繼續(xù)上升，最終持續(xù)產(chǎn)生高滴度的GIP特異性抗體，抗體最終滴度優(yōu)于4輪免疫HBc-GIP蛋白疫苗或GIP核酸疫苗的水平(P＜0.05)。因此，經(jīng)過(guò)兩種疫苗的聯(lián)合免疫，可以獲得高滴度的GIP特異性抗體

11、IgG，顯示了良好的免疫效果。
　　 2、成功制備了攜帶GIP抗原序列的GIP-KLH蛋白疫苗，免疫高脂飲食大鼠后，GIP-KLH疫苗組第二次免疫接種后7天，即產(chǎn)生了高滴度GIP特異性抗體，如期繼續(xù)免疫接種，抗體水平進(jìn)一步增高，而KLH對(duì)照組則(如期皮下多點(diǎn)注射KLH)沒(méi)有此變化。結(jié)果說(shuō)明，經(jīng)過(guò)多次免疫GIP-KLH蛋白疫苗，可以獲得高滴度的GIP特異性抗體IgG，顯示了的良好免疫效果。
　　 3、各組動(dòng)物在試驗(yàn)中，進(jìn)食

12、情況無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，GIP-KLH疫苗免疫組與KLH對(duì)照組(如期皮下多點(diǎn)注射KLH)相比，體重增長(zhǎng)減少。在初始體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的前提下，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組于初次免疫后第63天，體重增長(zhǎng)開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(即初次免疫后第98天)，GIP-KLH疫苗組與KLH對(duì)照組相比，體重少增長(zhǎng)了48g(17％)。實(shí)驗(yàn)中GIP-KLH疫苗組空腹血糖及胰島素與KLH對(duì)照組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

13、r>　　 4、在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，開(kāi)放場(chǎng)試驗(yàn)(OFT)的測(cè)試結(jié)果顯示，GIP-KLH疫苗組與KLH對(duì)照組相比較，總路程(P＜0.01)、平均速度(P＜0.01)、活動(dòng)時(shí)間(P＜0.05)、活動(dòng)次數(shù)(P＜0.01)、在中央?yún)^(qū)域的活動(dòng)次數(shù)(P＜0.05)均明顯低于KLH對(duì)照組，休息時(shí)間(P＜0.05)明顯高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。GIP-KLH疫苗組與KLH對(duì)照組相比，自發(fā)活動(dòng)性及在中央?yún)^(qū)域的活動(dòng)次數(shù)減低，因此GIP-KLH疫苗的主動(dòng)免疫影

14、響到了大鼠的行為活動(dòng)及精神狀態(tài)。在Morris水迷宮測(cè)試(MWM)中，GIP-KLH疫苗組與KLH對(duì)照組動(dòng)物在4天的訓(xùn)練階段中均表現(xiàn)為逃避潛伏期和游泳距離的縮短(分別為F=6.5；P=0.001 and F=5.3；P=0.002，)，以及游泳速度的明顯增快(F=3.3；P=0.024)，結(jié)果表明兩組動(dòng)物都在努力學(xué)習(xí)定位隱藏的站臺(tái)，但是兩組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。在第5天的探索階段，兩組的表現(xiàn)也無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05

15、)。
　　 5、在高脂飲食大鼠初次免疫后第98天，以18氟-脫氧葡萄糖(18F-FDG)為示蹤劑，通過(guò)PET/CT檢測(cè)大鼠腦糖利用率。GIP-KLH疫苗組與KLH對(duì)照組相比，海馬區(qū)、大腦皮層的腦糖利用率減低(P＜0.05)，而嗅球及小腦的腦糖利用率無(wú)明顯差別(P＞0.05)。
　　 6、通過(guò)末端脫氧核苷?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的方法，觀察海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的增殖及凋亡

16、情況。在GIP-KLH疫苗組與KLH對(duì)照組的病理切片中均可觀察到TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(細(xì)胞核棕色著色)及PCNA陽(yáng)性細(xì)胞(細(xì)胞核棕色著色)，但GIP-KLH疫苗組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較KLH對(duì)照組明顯增多，說(shuō)明GIP-KLH疫苗組海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的增殖及凋亡均增加。
　　 結(jié)論：以HBc(1-144a.a.)或KLH為載體，制備GIP疫苗，可以有效地誘導(dǎo)靶向大鼠GIP的特異性體液免疫反應(yīng)，打破大鼠自身抗原耐受