雄激素、雌激素與IL-6和IL-8促卵巢癌細(xì)胞增殖分子機(jī)制的研究以及Raf激酶抑制蛋白與卵巢癌轉(zhuǎn)移關(guān)系的初步探討.pdf_第1頁
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1、目的:卵巢癌(OvarianCancer,OVCA)中90%以上起源于卵巢表面上皮,流行病學(xué)調(diào)查、實(shí)驗(yàn)研究及臨床資料分析表明OVCA的發(fā)生、發(fā)展與雌激素和雄激素關(guān)系密切。近年來研究表明,白細(xì)胞介素-6(Interleukine-6,IL-6)和白細(xì)胞介素-8(Interleukine-8,IL-8)在OVCA中高表達(dá),提示這兩種細(xì)胞因子可能在OVCA的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。目前關(guān)于雄激素、雌激素及IL-6、IL-8兩種細(xì)胞因子

2、在OVCA中作用的機(jī)制尚不十分清楚。本課題探討了這兩種性激素與這兩種細(xì)胞因子對(duì)上皮性O(shè)VCA細(xì)胞增殖作用的影響,并對(duì)雄激素、雌激素與IL-6、IL-8兩種細(xì)胞因子間可能存在的相互調(diào)節(jié)作用及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行了研究。 另外,OVCA轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的主要原因,但有關(guān)其侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不明確。近期研究發(fā)現(xiàn)Raf激酶抑制蛋白(Rafkinaseinhibitorprotein,RKIP)在前列腺癌、乳腺癌、黑色素細(xì)胞瘤、胰島細(xì)胞瘤

3、等惡性腫瘤中表達(dá)減弱或丟失,RKIP基因很可能是前列腺癌、黑色素細(xì)胞瘤及乳腺癌的一種轉(zhuǎn)移抑制基因。然而,RKIP在OVCA中的表達(dá)及作用尚未見報(bào)道,為了研究RKIP與OVCA轉(zhuǎn)移的相關(guān)性,本課題初步探討了RKIP在OVCA組織及五種OVCA細(xì)胞系中表達(dá)的情況,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了RKIP在OVCA轉(zhuǎn)移和發(fā)展中的可能作用機(jī)制。 方法:本課題分兩部分進(jìn)行研究,第一部分雄激素、雌激素與IL-6和IL-8促OVCA細(xì)胞增殖分子機(jī)制的研

4、究。應(yīng)用免疫印跡(WesternBlot)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)技術(shù)對(duì)五種常見的人上皮性O(shè)VCA細(xì)胞系雄激素受體(androgenreceptor,AR)、雌激素受體(estrogenreceptor,ER)α、ERβ、IL-6受體(IL-6Rα、gp130)及IL-8受體(IL-8RA、IL-8RB)的表達(dá)進(jìn)行研究,選擇兼有AR和/

5、或ER、IL-6R及IL-8R的OVCA細(xì)胞系作為研究模型,應(yīng)用MTT法觀察5α-二氫睪酮(5α-dihydrotestosterone,DHT)、17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)及IL-6、IL-8兩種細(xì)胞因子對(duì)OVCA細(xì)胞體外增殖作用的影響;應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-1inkedimmnosorbentassay,ELISA)、RT-PCR、WesternBlot及熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)觀察DHT、E2

6、對(duì)OVCA細(xì)胞IL-6、IL-8及其受體表達(dá)的調(diào)節(jié)作用以及IL-6、IL-8對(duì)OVCA細(xì)胞AR、ERα、ERβ表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。第二部分RKIP與OVCA轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究。首先應(yīng)用免疫組化技術(shù)對(duì)人卵巢上皮性腫瘤組織(10例卵巢良性上皮性腫瘤、8例交界性O(shè)VCA及22例上皮性O(shè)VCA)和OVCA細(xì)胞系高轉(zhuǎn)移性HO-8910PM細(xì)胞及其母系細(xì)胞低轉(zhuǎn)移性HO-8910細(xì)胞中RKIP的表達(dá)和分布情況進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)應(yīng)用RT-PCR、WesternBl

7、ot及Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)對(duì)五種人上皮性O(shè)VCA細(xì)胞系的RKIP表達(dá)水平與其體外侵襲能力的相關(guān)性進(jìn)行分析。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用脂質(zhì)體法將含正義(sense,ss)或反義(antisense,as)RKIPcDNA的表達(dá)載體導(dǎo)入人OVCA細(xì)胞系SKOV-3,G418篩選陽性克隆后,WesternBlot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中RKIP蛋白的表達(dá)水平及RKIP表達(dá)對(duì)OVCA細(xì)胞MAP激酶活性的作用。分別應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞儀、雙層軟瓊脂

8、集落形成實(shí)驗(yàn)、體外細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)、ELISA及RT-PCR技術(shù),比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞體外增殖能力、細(xì)胞周期分布和凋亡、錨定非依賴性生長(zhǎng)能力、粘附和侵襲能力及IL-6和IL-8表達(dá)能力的變化。 結(jié)果:第一部分雄激素、雌激素與IL-6和IL-8促OVCA細(xì)胞增殖分子機(jī)制的研究結(jié)果顯示:(1)DHT和E2除促進(jìn)OVCA細(xì)胞增殖外還明顯提高其IL-6、IL-8的分泌,并對(duì)二者膜受體的表達(dá)有一定的調(diào)節(jié)作用。I

9、L-6和IL-8也可促進(jìn)OVCA細(xì)胞增殖。AR阻斷劑氟他胺(flutamide,F(xiàn)lu)和ER阻斷劑他莫昔芬(tamoxifen,Txf)可分別完全阻斷DHT和E2誘導(dǎo)的促增殖及IL-6和IL-8表達(dá)的作用,而抗IL-6/IL-8中和抗體則可部分阻斷二者的促增殖作用。IL-6和IL-8誘導(dǎo)的促增殖作用可被其相應(yīng)的中和抗體完全阻斷,也可被ER阻斷劑Txf部分阻斷,AR阻斷劑Flu非但不能阻斷IL-6和IL-8的促增殖作用,反而增強(qiáng)二者的促

10、增殖效應(yīng)。(2)在無雄激素的條件下,IL-6和IL-8除能增加AR表達(dá)外還能活化AR基因啟動(dòng)子;同樣,在無雌激素的條件下,IL-6和IL-8除能活化雌激素敏感基因啟動(dòng)子外還能上調(diào)功能性ERα的表達(dá)和下調(diào)ERβ蛋白的表達(dá);二者活化AR基因啟動(dòng)子及雌激素敏感基因啟動(dòng)子的作用可被AR阻斷劑Flu和ER阻斷劑Txf完全阻斷。(3)除wortmannin(PI-3K抑制劑)外,SB202190(p38MAPK抑制劑)、PD98059(MEK1/2

11、抑制劑)及tyrphostinAG879(ErbB2MAPK抑制劑)均可明顯阻斷IL-6誘導(dǎo)的ARmRNA增加及雌激素敏感基因啟動(dòng)子的活化;而PP2(Src抑制劑)則可明顯阻斷IL-8誘導(dǎo)的ARmRNA增加及雌激素敏感基因啟動(dòng)子的活化。 第二部分RKIP與OVCA轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究結(jié)果顯示:(1)上皮性O(shè)VCA患者組織中的RKIP表達(dá)水平明顯低于良性上皮性腫瘤和交界性O(shè)VCA患者的水平,其中低分化者顯著低于中分化和高分化者;(2)五

12、種上皮性O(shè)VCA細(xì)胞中RKIP的表達(dá)水平與其體外侵襲能力基本呈負(fù)相關(guān);(3)篩選出穩(wěn)定表達(dá)重組pcDNA3.1(+)-ssRKIP和pcDNA3.1(-)-asRKIP的SKOV-3細(xì)胞。RKIP表達(dá)水平對(duì)OVCA細(xì)胞中Raf-1介導(dǎo)的MEK和ERK基礎(chǔ)活化水平有抑制作用;(4)ssRKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力、錨定非依賴性生長(zhǎng)能力、粘附能力、侵襲能力及IL-8表達(dá)能力均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和/或未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組

13、細(xì)胞;asRKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力、錨定非依賴性生長(zhǎng)能力、粘附能力、侵襲能力及IL-8表達(dá)能力則明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和/或未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞;(5)與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染ssRKIP細(xì)胞呈現(xiàn)G1期細(xì)胞阻滯和G2+S期細(xì)胞比例下降,而轉(zhuǎn)染asRKIP細(xì)胞則呈G1期細(xì)胞比例減少和G2+S期細(xì)胞比例增加,提示RKIP通過改變細(xì)胞周期分布,而不是通過誘導(dǎo)凋亡(各組細(xì)胞均未見明顯的凋亡峰)抑制OVCA

14、細(xì)胞的生長(zhǎng)。 結(jié)論:本課題初步闡明了雄激素、雌激素與細(xì)胞因子IL-6和IL-8共同促進(jìn)OVCA生長(zhǎng)和發(fā)展的一個(gè)嶄新機(jī)制,即兩種性激素與IL-6和IL-8兩種細(xì)胞因子可能在OVCA進(jìn)展中交互調(diào)節(jié)形成級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。 RKIP基因不僅對(duì)OVCA細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有抑制作用,且對(duì)其生長(zhǎng)也有抑制作用。鑒于轉(zhuǎn)移抑制基因定義為該基因編碼的蛋白只抑制轉(zhuǎn)移癌生長(zhǎng),而不影響原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng),故我們認(rèn)為RKIP似乎并不是上皮性O(shè)VCA的轉(zhuǎn)移抑制基因

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