脂質(zhì)運載蛋白-2對人類卵巢癌細胞增殖能力的影響以及相關(guān)分子機制的研究.pdf

1、目的：卵巢癌患者早期癥狀隱匿，確診時已處于晚期，導致卵巢癌患者的死亡率居婦科腫瘤之首，對婦女生命造成嚴重威脅。脂質(zhì)運載蛋白-2（LCN2）是一種25kDa的外分泌型糖蛋白，有研究表明LCN2的表達量與卵巢癌的惡性程度密切相關(guān)。然而，有關(guān)LCN2在卵巢癌細胞中的作用及機制還不明確。本研究將檢測LCN2的表達與卵巢癌臨床病理特征的相關(guān)性，以及LCN2對卵巢癌細胞增殖活力的影響，并初步探討相關(guān)信號通路的分子機制。
　　方法：通過免疫組化

2、方法檢測LCN2在正常卵巢組織與卵巢腫瘤組織中的表達程度，統(tǒng)計評估LCN2與卵巢癌臨床病理特征的相關(guān)性；應用MTT細胞增殖實驗和平板細胞克隆形成實驗檢測過表達LCN2對卵巢癌細胞系（ES2和SKOV3）增殖活力的影響；通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LCN2質(zhì)粒DNA加藥物篩選的方法構(gòu)建穩(wěn)定過表達LCN2的卵巢癌細胞系；通過磷酸蛋白芯片篩選過表達LCN2后產(chǎn)生的相關(guān)差異表達的蛋白；應用Western Blot和細胞免疫熒光法驗證部分差異蛋白的亞細胞定位及表

3、達強度的變化。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組織化學結(jié)果：LCN2在正常卵巢組織中呈陰性表達，在卵巢癌組織中有不同程度的陽性表達。表達程度量化評分后，經(jīng)統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，LCN2在卵巢癌組織中表達量高于正常卵巢組織并與卵巢癌組織分化程度具有顯著性差異（P<0.0001）。
　　2.MTT細胞增殖實驗結(jié)果：選擇相對低表達LCN2的兩個卵巢癌細胞系（ES2和SKOV3），瞬時轉(zhuǎn)染LCN2質(zhì)粒和空白對照質(zhì)粒48h之后，過表達LCN

4、2組的細胞增殖活力高于對照組。
　　3.平板細胞克隆形成實驗結(jié)果：分別在ES2和SKOV3細胞中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染等量的LCN2質(zhì)粒和空白對照質(zhì)粒，經(jīng)G418篩選至克隆形成，結(jié)果顯示過表達LCN2組克隆形成率明顯多于對照組。
　　4.磷酸蛋白芯片實驗結(jié)果：在卵巢癌細胞系中，利用已經(jīng)成功構(gòu)建的穩(wěn)定高表達LCN2細胞系，磷酸蛋白芯片篩選結(jié)果顯示過表達LCN2組相對于對照組，ERK和GSK3β的磷酸化水平均明顯上調(diào)。
　　5.Wes

5、tern Blot檢測結(jié)果：首先在四種卵巢癌細胞系（ES2、SKOV3、CAOV3、OVCAR3）中分別檢測了LCN2、磷酸化ERK（p-ERK）、ERK、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）和GSK3β及β-catenin的蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)LCN2高表達的細胞系（CAOV3和OVCAR3）對比LCN2低表達的細胞系（ES2和SKOV3），磷酸化ERK和磷酸化GSK3β的表達水平上調(diào)。隨后，在穩(wěn)定過表達LCN2的ES2和SKOV3細胞系

6、中再次驗證LCN2、磷酸化ERK、ERK、磷酸化GSK3β和GSK3β的蛋白表達水平，結(jié)果顯示過表達LCN2上調(diào)了磷酸化ERK、磷酸化GSK3β和β-catenin的表達。
　　6.細胞免疫熒光結(jié)果：在SKOV3細胞系中瞬時轉(zhuǎn)染pEGFPN3和pEGFPN3-LCN2質(zhì)粒DNA，發(fā)現(xiàn)成功轉(zhuǎn)染LCN2組中，LCN2、磷酸化ERK、磷酸化GSK3β及β-catenin的表達強度相對于對照組有明顯增加。
　　結(jié)論：
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