引起葡萄卷葉及環(huán)斑癥狀的病毒種類鑒定及其分子特性研究.pdf

1、葡萄病毒病是影響葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。葡萄病毒病種類很多，其中，葡萄卷葉病和葡萄扇葉衰退病在我國發(fā)生普遍，危害嚴重。葡葡卷葉病的典型癥狀為卷葉，由幾種葡萄卷葉相關病毒(GLRaVs)引起。而葡萄扇葉衰退病的癥狀表現(xiàn)復雜，類型多樣，其中，引起環(huán)斑癥狀的相關病毒種類尚不明確。本研究對我國葡萄卷葉及環(huán)斑癥狀相關的病毒種類進行鑒定，并對相關病毒的分子特性進行研究。結果如下:
　　1.我國葡萄樣品中GLRaVs的檢測。本研究針對葡萄

2、卷葉相關病毒1、4和7(Grapevine leafroll-associated virus-1，-4和-7，GLRaV-1、4和7)的CP和HSP70基因設計引物，研究建立了這幾種病毒的巣式RT-PCR方法，對來自14個省和自治區(qū)的100余份葡萄樣品進行了檢測。檢測結果顯示巢式RT-PCR具有較高的靈敏度，能夠檢測更多的病毒分離物。GLRaV-1，GLRaV-4和GLRaV-7在這些樣品中的檢出率分別為27.3％(36/132)，4

3、3.2％(57/132)，23.4％(44/188)。
　　2.GLRaV-1、4和7中國分離物的遺傳多樣性分析。本研究共獲得GLRaV-1中國分離物的43條CP和21條HSP70基因序列。系統(tǒng)進化樹分析結果顯示全球的GLRaV-1分離物的CP和HSP70基因序列分別劃分為8個和7個組群，中國分離物分屬于其中的5個和4個組群。CP基因進化樹分析結果表明組4是一個新的組群。遺傳進化分析結果顯示屬于CP基因組群2和8的變種是由于自然選

4、擇而非隨機突變進化的結果。另外，在CP基因序列中發(fā)現(xiàn)3個新的重組序列。
　　本研究獲得了GLRaV-4的22條CP和19條HSP70基因序列，系統(tǒng)進化樹分析結果顯示GLRaV-4株系5、6、9、Pr和Car的變種形成各自獨立的分支，而其他的GLRaV-4變種可劃分為兩個組群，一些中國分離物與其他幾個國家的分離物劃分為group1，包含日本分離物Ru1和Ru2的組群劃分為group2。對HSP70基因序列的重組分析表明分離物LN-T

5、hs4 clone3和HB-JF clone4為重組序列。
　　本研究共獲得GLRaV-7分離物的45條CP和16條HSP70基因序列，基因變異分析結果表明獲得的CP基因序列的核苷酸/氨基酸的同源性為89.12％～100％/88.94％～100％，HSP70基因序列的核苷酸/氨基酸的同源性為85.33％～100％/88.97％～100％。系統(tǒng)進化樹分析表明所有的CP和HSP70基因序列可分別劃分5個和4個組群。CP和HSP70基因

6、進化樹中的組群3和4是兩個新的組群。此外，CP基因序列的重組分析表明分離物LN-ZF clone9的CP基因序列為一個重組序列。
　　3.一個新的雙生病毒及兩個新的GINV變種的基因組測定。對表現(xiàn)環(huán)斑癥狀的‘安尼斯基’、‘貝達’及健康的‘貝達’葡萄樣品進行小RNA測序，發(fā)現(xiàn)了一個新的雙生病毒及GINV的兩個新變種。采用PCR擴增及滾環(huán)擴增方法對‘安尼斯基’中的雙生病毒基因組進行擴增，確定雙生病毒基因組全長為2905 bp。該基因組

7、具有雙生病毒特有的高度保守的核苷酸序列TAATATTAC，其ORFs(Open readingframes)預測結果顯示該雙生病毒包含7個ORFs，其中6個ORFS與已報道雙生病毒的ORFs同源性為23％～67％。本研究表明該雙生病毒為葡萄上發(fā)現(xiàn)的一個新病毒，由于它似乎不能引起葡萄明顯的癥狀，故暫時命名為葡萄潛隱雙生病毒(Grapevinelatent geminivirus,GLGV)。
　　本研究獲得了兩個中國GINV分離物L

8、N_ANSJ_RS(GenBanK登錄號:KU971246)和LN_BETA_RS(GenBanK登錄號:KU234316)，其與日本分離物(D88448)的RP基因的核苷酸/氨基酸同源性分別為71.02％/76.75％和71.29％/77.15％，CP基因的核苷酸/氨基酸同源性分別為78.91％/86.67％和80.27％/89.74％。中國分離物LN_ANSJ_ RS和LN_ BETA_ RS之間RP和CP之間的核苷酸/氨基酸同源性

9、為74.87％/82.09％，83.16％/94.36％。GINV與發(fā)狀病毒屬（Trichovirus）其他成員的RP、MP及CP基因的氨基酸進化樹分析結果表明LN_ANSJ_ RS、LN_BETA_RS及日本分離物處于GINV大分支上的3個不同的小分支上，為GINV的3個不同的變種。這是GINV在中國的首次報道。研究結果也初步表明GINV與環(huán)斑癥狀緊密相關。
　　4.GINV的檢測及遺傳多樣性分析。針對GINV分離物的MP和CP