JN219抗輪狀病毒機(jī)理研究模型的建立.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)一株真菌菌絲的代謝產(chǎn)物具有抗病毒活性，用硅膠柱層析和制備型高效液相色譜得到了具有抗病毒活性的純品，命名為JN219。JN219極性較強(qiáng)，在220nm有最大的紫外吸收峰，質(zhì)譜(ESI)測(cè)得該化合物分子量為519道爾頓。體外抗病毒活性跟蹤發(fā)現(xiàn)JN219具有抗輪狀病毒(RV)活性，在μg-ng/ml水平可使1000個(gè)TCID50/ml的HCMV、VSV、RV完全喪失感染活力；體內(nèi)療效模型研究發(fā)現(xiàn)，JN219可以緩解RV(SA11株

2、)感染引起的乳鼠腹瀉。初步表明JN219不僅僅在體外有顯著抑毒效果，而且體內(nèi)效果顯著。明確抗病毒機(jī)制是藥物應(yīng)用臨床的先決條件之一。為研究JN219的抗RV機(jī)制，本研究小組進(jìn)行了初步的探索，發(fā)現(xiàn)JN219可能是作用于病毒復(fù)制周期最初黏附.融合.穿入階段，通過阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)抗病毒作用，那么JN219在RV穿入細(xì)胞過程中，如何阻斷病毒穿入發(fā)揮抗病毒效果的?本研究采用原核載體克隆表達(dá)輪狀病毒外殼蛋白VP4及其亞單位VP5*、VP8*，

3、用體外細(xì)胞培養(yǎng)病毒感染模型競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)建立抗RV機(jī)理研究模型，為探討JN219抑制RV穿入宿主細(xì)胞的分子靶位、明確JN219抑制病毒穿入宿主細(xì)胞機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 目的：建立研究JN219阻止RV穿入細(xì)胞的研究模型，為探討JN219抑制RV穿入機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.RV膜蛋白VP4、VP5*、VP8*的克隆表達(dá)和純化 (1)構(gòu)建pET30a(+)VP4、pET30a(+)VP5*、pET30a(+)VP

4、8*表達(dá)載體 在GeneBank查得RVVP4全基因序列，以RV之細(xì)胞培養(yǎng)物作為模板用RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因，與pET30a載體連接后轉(zhuǎn)化BL21(plysS)，用PCR、酶切方法鑒定后挑選陽性菌落委托測(cè)序。 (2)誘導(dǎo)表達(dá)、純化目的蛋白 將陽性菌落擴(kuò)增、提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(plysS)菌株，用IPTG誘導(dǎo)、SDS-PAGE方法檢追蹤研究表達(dá)條件、用鎳柱層析純化目的蛋白(6×his標(biāo)簽)。用標(biāo)簽抗體-We

5、sternblot方法進(jìn)行鑒定。 2.JN219抑制RV穿入過程研究模型的建立 (1)純化蛋白毒性研究 將VP4、VP5*、VP8*梯度稀釋后接種MA104細(xì)胞，與細(xì)胞對(duì)照比較，通過細(xì)胞病變觀察重組蛋白的細(xì)胞毒性。 (2)JN219抑制RV細(xì)胞穿入現(xiàn)象的確定 a)病毒接種細(xì)胞1h，病毒完成穿入過程后接種JN219到多孔板細(xì)胞上，根據(jù)細(xì)胞病變判斷JN219作用效果。若不出現(xiàn)病毒病變，可表明JN219

6、具有抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄復(fù)制的作用。 b)將JN219與病毒作用1h后接種于細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞病變判斷JN219抗病毒活性；若不出現(xiàn)病毒病變，說明JN219在病毒穿入細(xì)胞前發(fā)揮抗病毒作用，抑制了病毒的穿入過程。 c)將紫外線滅活的病毒與JN219作用后，將混合液與病毒作用1h接種細(xì)胞，觀察滅活的病毒是否競(jìng)爭(zhēng)了JN219的抗病毒穿入位點(diǎn)，來探討JN219是否通過作用于病毒外殼融合蛋白而實(shí)現(xiàn)抑制病毒的機(jī)制。 (3)JN219

7、阻止RV穿入過程分子機(jī)制研究模型的建立(競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)) 上述試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，JN219作用于病毒復(fù)制周期最初黏附-融合-穿入階段，通過阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)抗病毒作用。如果將JN219與VP4、VP5*、VP8*作用(與JN219的抗病毒穿入位點(diǎn)結(jié)合)，則JN219在后續(xù)的抗病毒試驗(yàn)過程中可能喪失抗病毒活性，通過該模型，可明確JN219抑制RV穿入過程的分子靶位。 結(jié)果： 1.RV膜蛋白VP4、VP5*、VP8*的克

8、隆表達(dá)和純化 (1)構(gòu)建pET30a(+)VP4、pET30a(+)VP5*、pET30a(+)VP8*表達(dá)載體 經(jīng)PCR和酶切鑒定證實(shí)構(gòu)建的pET30a(+)VP4、pET30a(+)VP5*、pET30a(+)VP8*質(zhì)粒目的基因分子量與預(yù)測(cè)分子量均一致，通過GeneBank序列比對(duì)，pET30a(+)VP4質(zhì)粒前780bp處有5個(gè)堿基發(fā)生突變，后870bp處有2個(gè)堿基發(fā)生突變，經(jīng)蛋白分析軟件分析認(rèn)為不影響其功能。

9、 (2)誘導(dǎo)表達(dá)、純化目的蛋白 pET30a(+)VP4、pET30a(+)VP5*、pET30a(+)VP8*的BL21(plysS)菌株用IPTG誘導(dǎo)、經(jīng)His-鎳柱層析純化了目的蛋白，VP4、VP5*、VP8*三個(gè)蛋白的純度均達(dá)到90％，VP4為0.24μg/ml、VP5*為0.8μg/ml、VP8*為0.5μg/ml。它們均與標(biāo)簽抗體發(fā)生反應(yīng)(Westernblot)。 2.JN219抑制RV穿入過程研究模

10、型的建立 (1)純化蛋白毒性研究：將VP4、VP5*、VP8*梯度稀釋后接種MA104細(xì)胞，與細(xì)胞對(duì)照比較，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞病變發(fā)生。 (2)JN219抑制RV細(xì)胞穿入現(xiàn)象的確定 a)病毒接種細(xì)胞1h、病毒完成穿入過程后用JN219攻擊，與病毒對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞病變率低，表明JN219對(duì)病毒基因復(fù)制轉(zhuǎn)錄表達(dá)有抑制作用。 b)將JN219與病毒作用1h后接種細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)基本正常，表明病毒感染過程

11、被抑制，且JN219作用機(jī)制與病毒黏附、穿入過程相關(guān)。 c)JN219與紫外滅活病毒充分作用后，再與RV作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)RV病變，表明JN219的抗病毒活性被紫外滅活的病毒消耗，提示JN219可能是與病毒外殼上某種功能蛋白發(fā)生作用，干擾了病毒穿入過程。 (3)JN219阻止RV穿入過程分子機(jī)制研究模型的建立(競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn))試驗(yàn) 設(shè)計(jì)將JN219與VP4、VP5*、VP8*作用，通過JN219在后續(xù)的抗病毒試

12、驗(yàn)過程中的細(xì)胞病變程度，判斷JN219抑制RV活性是否VP4、VP5*、VP8*所阻斷，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)初步明確JN219與VP4結(jié)合是其抗RV穿入機(jī)制之一。功能亞單位VP5*、VP8*是否是JN219作用位點(diǎn)有待后續(xù)研究確定。 結(jié)論： 1.采用原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，獲得了RV外殼蛋白VP4及其酶切片段VP5*、VP8*，VP4、VP5*、VP8*純度在90％左右。 2.建立病毒感染模型，初步確定JN219與VP4結(jié)合后，其