大鼠海馬抑制性氨基酸受體的功能調(diào)控.pdf

1、γ-氨基丁酸A型受體(GABA<,A>R)和甘氨酸受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)兩大重要的抑制性受體，根據(jù)二者在突觸內(nèi)、外所介導(dǎo)的抑制性電導(dǎo)特性的不同，將其介導(dǎo)的抑制效應(yīng)分為相位性抑制(phasic inhibition)和緊張性抑制(tonic inhibition)兩大類。突觸傳遞過程中，突觸前瞬時(shí)釋放的高濃度神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)或甘氨酸，作用并激活分布在突觸后區(qū)域的GABA<,A>R或甘氨酸受體，導(dǎo)致通道開放而引起氯離子內(nèi)流，進(jìn)一

2、步使突觸后細(xì)胞產(chǎn)生抑制。由于突觸釋放不是持續(xù)存在的，因而突觸后受體的激活也是間歇式的。抑制性氨基酸受體的這種間歇式激活所產(chǎn)生的對(duì)神經(jīng)元的抑制稱為相位性抑制。抑制性氨基酸受體除了介導(dǎo)由突觸內(nèi)受體產(chǎn)生的相位性抑制以外，近年來的研究越來越關(guān)注其介導(dǎo)的另外一種抑制形式——緊張性抑制，緊張性抑制是突觸外高親和力的抑制性氨基酸受體由細(xì)胞外本底就持續(xù)存在的內(nèi)源性氨基酸類遞質(zhì)，如GABA、甘氨酸以及?；撬岬燃せ疃a(chǎn)生。緊張性抑制的特點(diǎn)是，它不像相位性抑

3、制那樣嚴(yán)格受突觸傳遞的限制，其介導(dǎo)的抑制效應(yīng)持續(xù)存在，因而，緊張性抑制在控制神經(jīng)元興奮性方面被認(rèn)為比相位性抑制發(fā)揮了更為重要的作用。 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬區(qū)域，已經(jīng)有很多有關(guān)GABA<,A>R介導(dǎo)的緊張性抑制的報(bào)道。研究認(rèn)為緊張性抑制不僅參與了海馬學(xué)習(xí)記憶等功能的調(diào)節(jié)，還參與了像癲癇、經(jīng)前期焦慮失調(diào)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程。在海馬的不同區(qū)域，其介導(dǎo)緊張性抑制的GABA<,A>R亞基也不盡相同，如齒狀回顆粒細(xì)胞上的δ亞基、CA1和C

4、A3錐體神經(jīng)元上的α5亞基，甚至是僅由α和β亞基(不含任何第三類亞基)組成的功能性GABA<,A>R等都參與了海馬神經(jīng)元緊張性抑制的調(diào)節(jié)。 現(xiàn)有的研究認(rèn)為大腦海馬組織內(nèi)沒有功能性甘氨酸能突觸，然而卻有大量的甘氨酸受體亞基表達(dá)，并且無論是在急性分離的海馬神經(jīng)元、體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，還是在海馬腦片上的研究，都能記錄到明顯的甘氨酸受體激活的電流。此外，海馬神經(jīng)元細(xì)胞外有大量的能激活甘氨酸受體的內(nèi)源性配體如牛磺酸和β-丙氮酸等存在，這

5、也使甘氨酸受體的激活并發(fā)揮功能成為可能。近年來的研究也證明了甘氨酸受體在海馬中扮演的功能性角色，它能抑制海馬的突觸傳遞，并影響海馬的短期可塑性。目前認(rèn)為，甘氨酸受體的這種功能是通過細(xì)胞外持續(xù)存在的內(nèi)源性氨基酸配體(甚至一些未知的調(diào)節(jié)劑)激活突觸外甘氨酸受體，產(chǎn)生緊張性．抑制而發(fā)揮的。雖然緊張性抑制的功能越來越被人們所重視，然而，到目前為止，選擇性調(diào)節(jié)GABA能緊張性抑制的藥物并不多見。另外，對(duì)高位腦區(qū)甘氨酸受體介導(dǎo)的緊張性抑制的功能也在

6、逐漸被揭露。由于緊張性抑制在控制神經(jīng)元興奮性方面的重要作用，使得選擇性調(diào)節(jié)緊張性抑制的藥物的開發(fā)具有很好的前景。 因此在本課題中，一方面，我們從天然化合物入手，篩選并研究了以薄荷醇(menthol)為代表的萜類化合物對(duì)海馬抑制性氨基酸受體介導(dǎo)的緊張性抑制的調(diào)節(jié)作用。另一方面，通過異源表達(dá)甘氨酸受體的方法，發(fā)現(xiàn)并研究了環(huán)噻嗪(cyclothiazide，CTZ)對(duì)含有α2亞基的甘氨酸受體的選擇性抑制作用及其分子機(jī)制。 1.

7、薄荷醇通過增強(qiáng)GABA能緊張性抑制下調(diào)中樞神經(jīng)元興奮運(yùn)用電生理方法，我們發(fā)現(xiàn)薄荷醇可以降低培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的興奮性。同時(shí)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，薄荷醇可以抑制小鼠戊四氮(PTZ)注射以及大鼠電刺激海馬點(diǎn)燃所產(chǎn)生的癲癇發(fā)作。進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示，薄荷醇能增強(qiáng)低濃度GABA(與報(bào)道的在體動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞外空間存在的GABA濃度相接近)在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上激活GABA<,A>R所產(chǎn)生的電流。同時(shí)相對(duì)較高濃度的薄荷醇還可以激活培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上的GABA

8、<,A>R。進(jìn)一步在海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元上的研究顯示，薄荷醇選擇性抑制GABA<,A>R介導(dǎo)的緊張性電流，而對(duì)突觸部位GABA<,A>R介導(dǎo)的相位性突觸后電流無影響。這些結(jié)果因而表明薄荷醇可通過增強(qiáng)GABA<,A>R介導(dǎo)的緊張性抑制來下調(diào)海馬神經(jīng)元的興奮性。 為了進(jìn)一步排除薄荷醇抑制海馬神經(jīng)元興奮性是否有GABA<,A>R以外的機(jī)制的參與，我們利用電生理的手段，觀察了薄荷醇對(duì)海馬神經(jīng)元離子型谷氨酸受體和神經(jīng)元內(nèi)在興奮性的影

9、響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明薄荷醇不影響谷氨酸對(duì)離子型谷氨酸受體的激活，并對(duì)微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)無影響：同時(shí)對(duì)在阻斷興奮性和抑制性氨基酸受體離子通道的情況下，薄荷醇對(duì)神經(jīng)元電流注射所產(chǎn)生的動(dòng)作電位的發(fā)放特性無影響。表明薄荷醇不影響神經(jīng)元的內(nèi)在膜興奮性。此外，胞內(nèi)游離鈣離子螯合實(shí)驗(yàn)表明薄荷醇對(duì)GABA<,A>R的增強(qiáng)效應(yīng)不受細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響。這些結(jié)果進(jìn)一步顯示薄荷醇是通過選擇性增強(qiáng)GABA<,A>R介導(dǎo)的緊張性抑制來發(fā)揮對(duì)海

10、馬神經(jīng)元的抑制。 緊接著對(duì)薄荷醇增強(qiáng)GABA<,A>R功能的結(jié)構(gòu)效應(yīng)關(guān)系的研究表明，薄荷醇的幾利，旋光異構(gòu)體均具有明顯的增強(qiáng)GABA<,A>R的作用。而薄荷醇的醇羥基取代物menthyl chloride和JE207對(duì)GABA<,A>R介導(dǎo)的電流無明顯增強(qiáng)作用，因而表明醇羥基在薄荷醇增強(qiáng)GABA<,A>R方面起關(guān)鍵作用。 2.薄荷醇對(duì)異聚體甘氨酸受體的相對(duì)高敏感性抑制通過全細(xì)胞電壓鉗技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)，薄荷醇濃度依賴性地抑制甘氨酸在

11、海馬神經(jīng)元上激活的電流，并且這種抑制作用具有非競爭性和電壓不依賴性的特性。同時(shí)，薄荷醇對(duì)甘氨酸受體的抑制不依賴于其產(chǎn)生的GABA<,A>R激活。胞內(nèi)鈣離子螯合實(shí)驗(yàn)表明這種抑制作用同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度不依賴性的。通過對(duì)不同給藥模式下，薄荷醇抑制甘氨酸電流的特點(diǎn)進(jìn)行分析表明，薄荷醇可能同時(shí)通過變構(gòu)調(diào)控和開放通道阻斷兩種方式對(duì)甘氨酸受體產(chǎn)生抑制效應(yīng)。進(jìn)一步在異源表達(dá)甘氨酸受體的HEK293T細(xì)胞上的研究提示，薄荷醇對(duì)含有α2亞基的甘氨

12、酸受體具有更高的敏感性，而甘氨酸異聚體中β亞基的加入，可以進(jìn)一步增加薄荷醇的敏感性，導(dǎo)致薄荷醇對(duì)α2β異聚體甘氨酸受體具有更強(qiáng)的抑制效應(yīng)。 3.環(huán)噻嗪對(duì)含有α2亞基的甘氨酸受體的特異性抑制在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上，致癇劑環(huán)噻嗪強(qiáng)有力地抑制甘氨酸激活的電流。其抑制作用具有甘氨酸濃度依賴的特性，對(duì)飽和濃度甘氨酸激活的電流，環(huán)噻嗪不能產(chǎn)生抑制，因而表明環(huán)噻嗪對(duì)甘氨酸受體抑制的競爭性特性。在異源表達(dá)甘氨酸受體的HEK293T細(xì)胞上，我們發(fā)現(xiàn)

13、環(huán)噻嗪只抑制含有α2亞基的甘氨酸受體所介導(dǎo)的電流，因此表明環(huán)噻嗪對(duì)甘氨酸受體抑制的α2亞基選擇性。由于脊髓神經(jīng)元甘氨酸受體在發(fā)育過程中有著從α2亞基向α1亞基轉(zhuǎn)變的模式，因此，我們?cè)诓煌囵B(yǎng)天數(shù)的脊髓神經(jīng)元上觀察了環(huán)噻嗪對(duì)甘氨酸激活電流的抑制情況，結(jié)果表明環(huán)噻嗪對(duì)體外培養(yǎng)5-7天的脊髓背角神經(jīng)元上甘氨酸激活的電流具有顯著的抑制作用，而隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，到了體外培養(yǎng)兩周后，其抑制作用顯著減弱。因此進(jìn)一步證實(shí)了環(huán)噻嗪對(duì)甘氨酸受體抑制作

14、用的α2亞基選擇性。 通過序列比對(duì)和點(diǎn)突變的方法，我們對(duì)環(huán)噻嗪抑制甘氨酸受體的作用位點(diǎn)進(jìn)行了研究，結(jié)果證實(shí)α2亞基細(xì)胞外N末端第59位上的蘇氨酸在環(huán)噻嗪抑制含有α2業(yè)基的甘氨酸受體方面起非常重要的作用。 綜上所述，本研究有如下創(chuàng)新之處：1)首次研究并發(fā)現(xiàn)了日常生活中廣泛應(yīng)用的天然化合物薄荷醇可以通過調(diào)節(jié)GABA<,A>R和甘氨酸受體所介導(dǎo)的緊張性抑制而產(chǎn)生中樞效應(yīng)。并發(fā)現(xiàn)一些其他萜類化合物也能調(diào)節(jié)GABA<,A>R介導(dǎo)的