大菱鲆幼魚幾種功能性氨基酸營養(yǎng)代謝的研究.pdf

1、以我國北方重要經(jīng)濟(jì)海水養(yǎng)殖魚類大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)為研究對象,在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行攝食生長實(shí)驗(yàn),研究飼料中精氨酸和谷氨酰胺水平對大菱鲆幼魚生長、免疫及精氨酸代謝的影響;研究飼料中支鏈氨基酸水平對大菱鲆幼魚生長和飼料利用的影響,并從分子層面探討支鏈氨基酸代謝的調(diào)控機(jī)制;研究高植物蛋白飼料中添加羥脯氨酸和脯氨酸對大菱鲆幼魚生長和膠原蛋白代謝的影響。本文研究內(nèi)容和主要研究結(jié)果如下:
　　1.飼料

2、中精氨酸和谷氨酰胺水平對大菱鲆幼魚生長、非特異性免疫力、疾病抵抗力及精氨酸代謝的影響
　　本實(shí)驗(yàn)旨在研究飼料中精氨酸(Arg)和谷氨酰胺(Gln)水平對大菱鲆幼魚生長、非特異性免疫力、疾病抵抗力及精氨酸代謝的影響。以白魚粉(23％)、豆粕(16%)和玉米蛋白粉(23%)為主要蛋白源配制出粗蛋白含量50%、粗脂肪含量12%的基礎(chǔ)飼料,在基礎(chǔ)飼料中分別添加不同梯度的Arg(0.0、1.0和2.0%)和Gln(0.0、1.0和2.0%)

3、,配制出9組等氮等脂的實(shí)驗(yàn)飼料。在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行攝食生長實(shí)驗(yàn),每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)35尾魚,每天定量投喂2次,養(yǎng)殖周期12周。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,以愛德華氏菌感染實(shí)驗(yàn)魚,并記錄感染7 d后的存活率。結(jié)果表明,飼料中Arg和Gln水平對大菱鲆幼魚生長性能未產(chǎn)生顯著影響,但在未添加Gln處理組,存活率隨飼料中Arg水平的升高而顯著升高(P<0.05)。總體上,頭腎呼吸爆發(fā)活力、血清溶菌酶和谷胱甘肽過氧化物酶活力均隨飼料中Arg

4、和/或Gln水平升高而顯著升高(P<0.05)。感染愛德華氏菌后,存活率隨飼料中Arg水平升高而顯著升高(P<0.05),但Gln添加對其并未產(chǎn)生顯著影響且與Arg之間不存在交互作用(P>0.05)。飼料中Arg和Gln水平顯著影響了血清和肝臟中誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶活力(P<0.05)。肝臟中Arg酶I基因表達(dá)隨飼料中Arg和Gln水平升高而顯著升高,且Arg和Gln之間存在顯著交互作用(P<0.05)。綜上結(jié)果,飼料中Arg和Gln水

5、平升高顯著提高了大菱鲆幼魚非特異性免疫力,且飼料中Arg水平的升高顯著提高了疾病抵抗力。同時(shí),飼料中Arg和Gln能夠調(diào)控NO合成和Arg代謝。
　　2.飼料中支鏈氨基酸水平對大菱鲆幼魚生長、飼料利用和TOR信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　在飼料中添加不同水平亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)和纈氨酸(Val),研究其對大菱鲆幼魚(初重4.64±0.004 g)生長、飼料利用和TOR信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響。以白魚粉(2

6、2%)、蝦殼粉(11%)和花生粕(26%)為主要蛋白源,魚油為主要脂肪源,采用3×3雙因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),Leu添加水平分別為0.0、1.0和2.0%,異亮氨酸(Ile)和纈氨酸(Val)以3:4比例作為一個(gè)整體(命名為Ile+Val),添加水平分別為0.0、1.4和2.8%,配制出9組等氮(50%粗蛋白)等脂(12%粗脂肪)實(shí)驗(yàn)飼料,實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)35尾魚,每天飽食投喂2次,養(yǎng)殖周期為10周。結(jié)果

7、表明,在較低Ile+Val添加水平時(shí)(0.0和1.4%),添加適中的Leu(1.0%)顯著提高了大菱鲆幼魚的特定生長率(SGR),添加過高的Leu(2.0%)反而降低了SGR(P<0.05),但在高Ile+Val添加水平時(shí)(2.8%),Leu水平未對SGR產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。另外,在適中Leu添加水平(1.0%)時(shí),隨Ile+Val添加水平升高,SGR顯著降低(P<0.05)。飼料中 Leu水平顯著影響了大菱鲆幼魚的飼料效率(

8、FER)和蛋白質(zhì)效率(PER),且與Ile+Val之間存在顯著交互作用(P<0.05)。當(dāng)飼料中Leu和Ile+Val添加水平分別為1.0和0.0%時(shí),FER和PER達(dá)到最大值并顯著高于其他處理組(P<0.05)。同時(shí),飼料中適宜Leu與Ile+Val水平顯著提高了大菱鲆幼魚對飼料干物質(zhì)和粗蛋白的表觀消化率(P<0.05),且兩者之間存在顯著交互作用(P<0.05)。對TOR信號通路相關(guān)基因表達(dá)分析顯示,飼料中Leu與Ile+Val水平

9、對大菱鲆幼魚肝臟和肌肉中TOR和4E-BP1基因表達(dá)未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。飼料中Leu和/或Ile+Val水平升高提高了大菱鲆肝臟中4E-BP2基因表達(dá)(P<0.05),但對肌肉中4E-BP2基因表達(dá)未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。綜上結(jié)果,飼料中添加1.0%Leu和0.0%Ile+Val能夠促進(jìn)大菱鲆幼魚生長和飼料利用,但當(dāng)Leu與Ile+Val比例不平衡時(shí),會(huì)對生長和飼料利用產(chǎn)生抑制作用。飼料中BCAA水平對TOR、4E-

10、BP1和4E-BP2基因(肝臟4E-BP2基因除外)表達(dá)未產(chǎn)生顯著影響。
　　3.大菱鲆支鏈酮酸脫氫酶激酶基因克隆、序列分析及飼料中BCAA水平對其 mRNA表達(dá)量的影響
　　本實(shí)驗(yàn)以大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)為研究對象,采用同源克隆技術(shù)和 RACE技術(shù)從大菱鲆肝臟中成功克隆得到支鏈酮酸脫氫酶激酶(BCKDK)基因cDNA全序列1713 bp(Genbank登錄號:KJ489027),其中開放閱

11、讀框1314 bp,編碼437個(gè)氨基酸,預(yù)測分子量約為4.8831 kDa,理論等電點(diǎn)9.19。BLAST分析顯示大菱鲆BCKDK基因與其它脊椎動(dòng)物該基因具有較高相似度。與其他脊椎動(dòng)物BCKDK基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,發(fā)現(xiàn)其基因系統(tǒng)發(fā)育樹與形態(tài)學(xué)分類具有較好的相關(guān)性。采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測飼料中BCAA水平對大菱鲆肝臟和肌肉中BCKDK基因mRNA表達(dá)量的影響。結(jié)果表明,飼料中Leu和Ile+Val水平升高顯著降低了大菱鲆幼魚肝臟中BC

12、KDK基因mRNA水平(P<0.05),但兩者之間未發(fā)現(xiàn)顯著交互作用(P>0.05)。飼料中Leu水平升高顯著降低了大菱鲆肌肉中BCKDK基因表達(dá)(P<0.05),且與Ile+Val之間存在顯著交互作用(P<0.05)。該研究結(jié)果表明,飼料中BCAA的拮抗作用可能與激活的BCAA氧化代謝有關(guān)。
　　4.高植物蛋白飼料中添加L-羥脯氨酸對大菱鲆幼魚生長、組織羥脯氨酸和膠原蛋白含量及脯氨酰4-羥化酶α(I)基因表達(dá)的影響
　　在

13、高植物蛋白飼料中添加L-羥脯氨酸(L-Hyp),研究其對大菱鲆幼魚(初重8.11±0.01 g)攝食、生長、飼料利用、組織Hyp和膠原蛋白含量及脯氨酰4-羥化酶α(I)(P4Hα(I))基因表達(dá)的影響。以白魚粉(15%)、豆粕(40%)和谷朊粉(14%)為主要蛋白源,分別在飼料中添加0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50%的L-Hyp,配制出7種等氮(50%粗蛋白)等脂(12%粗脂肪)的實(shí)驗(yàn)飼料(Hyp實(shí)測

14、值分別為0.12、0.33、0.51、0.60、0.80、1.03和1.23%)。實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行,每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)35尾魚,每天飽食投喂2次,養(yǎng)殖周期10周。結(jié)果表明,飼料中Hyp水平對大菱鲆幼魚生長性能和飼料利用均無顯著影響(P>0.05)。血漿游離Hyp、肝臟和肌肉總Hyp含量隨飼料中Hyp含量升高而顯著升高(P<0.05)。當(dāng)飼料中Hyp含量達(dá)到或超過0.60%時(shí),大菱鲆血漿游離 Hyp含量顯著高于其它

15、處理組組(P<0.05)。1.03和1.23%Hyp組肝臟中總Hyp含量顯著高于0.12和0.33%Hyp組(P<0.05)。當(dāng)飼料中Hyp含量達(dá)到或超過0.60%時(shí),大菱鲆肌肉中總Hyp和膠原蛋白含量也顯著高于其它處理組(P<0.05),并在1.23% Hyp組達(dá)到最大值且顯著高于其他處理組(P<0.05)。但脊柱總 Hyp和膠原蛋白含量不受飼料中 Hyp水平的影響(P>0.05)。肝臟P4Hα(I)基因表達(dá)在各處理組間無顯著差異(P

16、>0.05),但肌肉P4Hα(I)基因在高Hyp組的表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.05)。綜上結(jié)果,在高植物蛋白飼料中添加 L-Hyp對大菱鲆幼魚生長性能未產(chǎn)生促進(jìn)作用,但顯著提高了組織Hyp和肌肉總膠原蛋白含量。雖然飼料中Hyp水平升高未對肝臟中P4Hα(I)基因表達(dá)產(chǎn)生顯著影響,但顯著降低了肌肉中P4Hα(I)基因表達(dá)。
　　5.飼料中脯氨酸和羥脯氨酸水平對大菱鲆幼魚膠原蛋白合成和P4Hα(I)基因表達(dá)的影響
　　本實(shí)

17、驗(yàn)旨在研究在含高植物蛋白飼料中添加脯氨酸或同時(shí)添加脯氨酸和羥脯氨酸對大菱鲆幼魚(初重8.12±0.01 g)生長性能、組織羥脯氨酸和膠原蛋白含量及P4Hα(I)基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料(對照組)中粗蛋白和粗脂肪含量分別為50%和12%,在基礎(chǔ)飼料中添加0.75%脯氨酸(Pro-0.75組)或同時(shí)添加0.75%脯氨酸和0.75%羥脯氨酸(Pro+Hyp組),配制出3組等氮等脂的實(shí)驗(yàn)飼料。實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行,每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù),

18、每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)35尾魚,每天飽食投喂2次,養(yǎng)殖周期10周。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,飼料中添加脯氨酸和羥脯氨酸對大菱鲆幼魚生長性能和飼料利用均無顯著影響(P>0.05),但肌肉中總羥脯氨酸和膠原蛋白含量隨飼料中脯氨酸和羥脯氨酸水平升高而顯著升高(P<0.05),并且Pro+Hyp組大菱鲆血漿中游離羥脯氨酸含量顯著高于其他處理組(P<0.05)。Pro-0.75組大菱鲆肝臟和肌肉中P4Hα(I)基因表達(dá)水平最高且顯著高于對照組(P<0.05),但 Pr