帕金森病相關(guān)蛋白-Nurr1對酪氨酸羥化酶及p53轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控.pdf

1、帕金森病(PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，它是繼阿爾海默茲病的世界上第二常見的神經(jīng)退行性疾病，大約影響了60歲以上人口的百分之一。帕金森病表現(xiàn)為靜止性振顫，僵直，運動徐緩等臨床特征。PD主要的病理特征是中腦多巴胺能神經(jīng)元的喪失和路易小體的形成。但是，PD的確切病因卻仍然不清楚。目前已發(fā)現(xiàn)多種基因與PD的發(fā)生直接相關(guān)，其中一種就是Nurr1。 Nurr1是孤核受體家族成員之一，人們至今沒有發(fā)現(xiàn)這類家族成員相應的配體。Nurr1

2、在多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育和存活過程中起著十分重要的作用。Nurr1序列的突變-291Tdel和-254T→G已在家族性PD病人中發(fā)現(xiàn)，并且這兩種突變體降低了酪氨酸羥化酶(TH)的表達，這說明Nurr1與PD的發(fā)生直接相關(guān)。Nurr1作為轉(zhuǎn)錄因子，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是它改變其轉(zhuǎn)錄活性的重要手段之一。最近，有文獻報道了Nurr1有抗凋亡功能，但具體機制不明。 本論文主要探討了Nurr1被ERK2磷酸化，并且磷酸化的Nurr1的轉(zhuǎn)錄活性

3、有所提高，導致TH的表達量升高；Nurr1通過與p53的結(jié)合，影響p53的轉(zhuǎn)錄活性，表現(xiàn)出促細胞存活的能力。主要研究結(jié)果如下： 1.我們運用了體外結(jié)合實驗和免疫共沉淀方法，發(fā)現(xiàn)Nurr1與ERK2在體外和細胞內(nèi)(二者蛋白共轉(zhuǎn)染)的情況下，這兩個蛋白可以結(jié)合。并且通過體外磷酸化的實驗證明了Nurr1能夠被活化的ERK2磷酸化。我們制備了Nurr1的不同潛在ERK2結(jié)合結(jié)構(gòu)域的缺失突變體，通過進一步的體外結(jié)合實驗，闡述了Nurr1序

4、列當中與ERK2的結(jié)合位點。而且通過將Nurr1序列當中的一共6個預測的ERK2的磷酸化位點的缺失或者點突變，進行體外磷酸化的實驗，證實了Nurr1序列當中的S126和T132為主要的磷酸化位點，T129和T185為次要的磷酸化位點。我們進一步探討了被ERK2磷酸化的Nurr1的轉(zhuǎn)錄活性是否發(fā)生變化，我們通過報告基因的實驗，驗證了被ERK2磷酸化的Nurr1提高了Nurr1下游的TH的表達量，并且將Nurr1序列當中的ERK2磷酸化位點

5、突變后，對TH的提高效應就消失了。這些結(jié)果提示，Nurr1能夠被ERK2磷酸化，并且被ERK2磷酸化后的Nurr1的轉(zhuǎn)錄活性提高了。 2.我們通過過度表達Nurr1在不同的真核細胞中，發(fā)現(xiàn)Nurr1能夠降低促凋亡基因Bax的表達，并且通過RNA干擾的手段將消減Nurr1在這些細胞中的表達，檢測到Bax的表達水平上升。由于Bax的表達量的降低會導致細胞存活，故而采取了MTT的方法來驗證了過度表達Nurr1確實能夠提高細胞存活率，并

6、且在誘導凋亡藥物-阿霉素的刺激下，Nurr1仍然有著促細胞存活的功能。由于Bax是p53的靶基因，因而我們用體外結(jié)合實驗和免疫共沉淀的實驗來驗證了Nurr1與p53之間的結(jié)合，我們又通過報告基因?qū)嶒烌炞C了Nurr1能夠抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性，導致了p53的下游靶基因的表達降低。我們運用p53和Nurr1不同缺失突變體進行了體外結(jié)合實驗，找出了Nurr1的DBD和p53結(jié)合，p53的羧基端與Nurr1結(jié)合。接下來，我們進一步探討了Nurr1

7、是如何影響p53的轉(zhuǎn)錄的。通過報告基因?qū)嶒?，我們發(fā)現(xiàn)Nurr1對p53的轉(zhuǎn)錄影響是依賴于這兩個蛋白的相互結(jié)合的；并且通過體外競爭結(jié)合實驗，發(fā)現(xiàn)Nurr1與p53的結(jié)合影響了p53的低聚物的形成，最終導致了p53的轉(zhuǎn)錄活性的降低。 通過以上結(jié)果，我們闡述了Nurr1被ERK2的磷酸化修飾，提高TH的表達，以及Nurr1通過抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性來實現(xiàn)的其保護功能，這一發(fā)現(xiàn)可能為我們更好地了解帕金森病的發(fā)病機制，尋求治療帕金森病的方法