TAT-LHRH修飾的殼聚糖-DNA納米粒的細(xì)胞內(nèi)吞途徑的研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和基因工程技術(shù)的進(jìn)步，基因治療成為一種新型治療模式，在遺傳性疾病、惡性腫瘤、心血管疾病、艾滋病等疾病的治療中有著廣闊的運(yùn)用前景。基因治療載體的選擇是基因治療成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；蛑委熭d體包括病毒載體、非病毒載體和細(xì)菌載體。非病毒載體具有較低的免疫原性、低細(xì)胞毒性、較大的基因負(fù)載量、制備簡單等優(yōu)點(diǎn)，顯示了其作為基因治療載體的優(yōu)越性。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期工作表明，TAT-LHRH修飾的殼聚糖/DNA納米粒（T

2、LCDN）呈現(xiàn)出對HepG2較高的轉(zhuǎn)染效率和靶向性，但其以何種方式進(jìn)入細(xì)胞尚不清楚。本研究通過攝入抑制實(shí)驗(yàn)、共定位實(shí)驗(yàn)以及阻斷不同細(xì)胞內(nèi)吞途徑對基因轉(zhuǎn)染效率的影響三部分實(shí)驗(yàn)，旨在探索TAT-LHRH修飾的殼聚糖/DNA納米粒的細(xì)胞內(nèi)吞途徑。
　　 采用復(fù)凝集法，將熒光標(biāo)記的質(zhì)粒DNA與TAT-LHRH修飾的殼聚糖或未經(jīng)修飾的殼聚糖混合制備TLCDN和殼聚糖/DNA納米粒(CDN)。觀察3種內(nèi)吞途徑抑制劑chlorpromazin

3、e(CPM)、filipin(FP)或dynasore(DS)對HepG2細(xì)胞攝入TLCDN或CDN的影響，同時檢測攝入抑制后的基因轉(zhuǎn)染效率。再者，將TLCDN和CDN與3種內(nèi)吞途徑標(biāo)志物轉(zhuǎn)鐵蛋白、霍亂毒素B、右旋糖苷共孵育，計算納米粒與3種標(biāo)志物的共定位率。
　　 結(jié)果：顯示，1）網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞途徑抑制劑CPM對TLCDN攝入的抑制作用低于對CDN攝入的抑制作用（抑制率分別為12.0％、47.7%）；小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑

4、抑制劑FP明顯抑制HepG2對TLCDN的攝入（抑制率為55.4%），但對CDN的攝入則起促進(jìn)作用（促進(jìn)率為29.6%）；雙途徑抑制劑DS能同時抑制HepG2對2種納米粒的攝入（抑制率分別為64.0%、62.6%），且程度基本相同。2）網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞途徑標(biāo)志物轉(zhuǎn)鐵蛋白與TLCDN的共定位率(15.2%)低于與CDN的共定位率(20.7%)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑標(biāo)志物霍亂毒素B與TLCDN共定位率(48.1%)顯

5、著高于與CDN的共定位率(9.1%)；巨胞飲途徑標(biāo)志物右旋糖苷與TLCDN的共定位率(28.5%)顯著低于與CDN的共定位率(48.0%)。3)在CPM作用下，TLCDN組HepG2基因表達(dá)抑制率(15.1%)顯著低于CDN組(47.0%)；在FP作用下，TLCDN組基因表達(dá)抑制率為58.7%,而CDN組基因表達(dá)促進(jìn)率為26.6%;在DS作用下，TLCDN組基因表達(dá)抑制率(65.6%)與CDN組(58.3%)相當(dāng)。
　　 綜上表