精氨酸-殼聚糖-DNA納米?？蒯孭ELA微球的制備及成骨誘導(dǎo)效能的研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建精氨酸修飾的精氨酸-殼聚糖共聚物，并與荷負(fù)電的pBMP-2自組裝凝聚成納米級(jí)粒子，檢測(cè)其納米粒度及Zeta電位性質(zhì)。體外驗(yàn)證納米粒子的入胞性能。研發(fā)出內(nèi)部包封有精氨酸-殼聚糖/pBMP-2納米粒的PELA微球，在體外探討PELA微球的成骨誘導(dǎo)效能。研究這種生物活性微球的粘彈性，表征，精氨酸-殼聚糖/pBMP-2納米粒的緩釋曲線，緩釋出納米粒子的生物活性，以及體外誘導(dǎo)成骨前體細(xì)胞的成骨分化能力。為今后骨損傷治療的應(yīng)用

2、提供一種新方法和新思路。
　　方法:
　　1.精氨酸-殼聚糖/pBMP-2納米粒的制備、表征及細(xì)胞轉(zhuǎn)染性能研究
　　將L-精氨酸及殼聚糖完全溶于pH5.0的四甲基乙二胺/鹽酸(TEMED/HCl)緩沖液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)作為激活劑及偶聯(lián)劑，氮?dú)獗Ｗo(hù)下磁力攪拌室溫連續(xù)反應(yīng)10h，去離子水中透析4天后冷凍干燥得到精氨酸-殼聚糖(Arg-CS)復(fù)合物，并

3、經(jīng)溴化鉀壓片及氘代重水溶解后行傅立葉紅外光譜及核磁共振1H譜驗(yàn)證合成物的分子結(jié)構(gòu)。通過(guò)自組裝凝聚法，將Arg-CS的醋酸鈉/醋酸溶液與pBMP-2的NaCl溶液，以N/P為4∶1的比例快速混合，靜置30min。透射電鏡下檢測(cè)精氨酸-殼聚糖/pBMP-2納米粒的粒徑及表征，馬爾文納米粒度儀分析精氨酸-殼聚糖/pBMP-2納米粒子的表面Zeta電位性質(zhì)。瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)分析精氨酸-殼聚糖作為基因載體保護(hù)DNA抗DNA酶降解的能力。

4、r>　　MC3T3-E1細(xì)胞用含10％FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80％融合后傳代。以2×105/孔加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞融合60％后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將Arg-CS/pBMP-2納米粒加入不含血清的α-MEM培養(yǎng)基中，以裸質(zhì)粒DNA及殼聚糖/pBMP-2納米粒為對(duì)照。于37℃、5％的CO2條件下孵育6h后，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72h的細(xì)胞熒光顯微鏡下觀察，并將細(xì)胞消化裂解，提取蛋白行western blot分析BMP-2

5、蛋白的表達(dá)。
　　2.包封精氨酸-殼聚糖/pBMP-2納米粒的PELA微囊的制備、表征及其緩釋能力研究
　　根據(jù)前期研究所得的優(yōu)化參數(shù)。以經(jīng)典的復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備包封Arg-CS/pBMP-2納米粒的PELA微囊。方法簡(jiǎn)述如下:取Arg-CS/pBMP-2納米?；鞈乙海ê?0μg質(zhì)粒）為內(nèi)水相(W1)，將300mg聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸溶解于二氯甲烷中為油相(O)。將內(nèi)水相加入油相，乳化10 min，形成初乳液(W1/O)

6、。再將初乳液加入40 mL1.0％的聚乙烯醇溶液(W2)中，乳化10min，形成復(fù)乳液(W1/O/W2)，800r/min攪拌40min，徹底揮發(fā)二氯甲烷。微囊離心10min，洗滌3次收集，冷凍干燥后，掃描電鏡觀察。
　　取上述制備的PELA微球置于4ml二氯甲烷中充分溶解微球后，加入2mlTE緩沖液充分振蕩，萃取出其內(nèi)的質(zhì)?；驕y(cè)定PELA微球內(nèi)部包封的質(zhì)粒基因的含量。同時(shí)取上述制備的PELA微球放入含1ml PBS的EP管中，

7、置于37℃恒溫箱內(nèi)。在固定的時(shí)間點(diǎn)（2，4，8，12，16，22，28，35，42天）取出樣品，EP管800r/min離心30分鐘，吸出緩釋液，儲(chǔ)存于-20℃，至檢測(cè)時(shí)解凍，加入適量殼聚糖酶溶液，微量分光光度計(jì)于260nm波長(zhǎng)處測(cè)定pBMP-2含量。
　　MC3T3-E1細(xì)胞以1×105/孔接種于6孔板，用含10％FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。同時(shí)，稱(chēng)取30mg包封有Arg-CS/pBMP-2納米粒的PELA微球粉末分散于培養(yǎng)基中

8、，以包封CS/pBMP-2納米粒，裸pBMP-2的PELA微球?yàn)閷?duì)照，置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于3、7、10、14、18、21天換液，上清液離心，收集。按照說(shuō)明書(shū)行ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)液中BMP-2的分泌含量。
　　3.包封精氨酸-殼聚糖/pBMP-2納米粒的PELA微囊體外成骨誘導(dǎo)效能的研究
　　MC3T3-E1細(xì)胞以1×105/孔接種于6孔板，稱(chēng)取30mg包封有Arg-CS/pBMP-2納米粒子的PELA

9、微球分散于培養(yǎng)液中，分別于7天、14天用0.2％的TritonⅩ-100裂解細(xì)胞，按照ALP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在520nm波長(zhǎng)讀取吸光度值。取誘導(dǎo)21天的細(xì)胞，4％多聚甲醛固定，蒸餾水洗3遍，1％茜素紅37℃下染色30min，吸去染色液，于顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)。
　　結(jié)果:
　　1.精氨酸-殼聚糖/pBMP-2納米粒的制備、表征及細(xì)胞轉(zhuǎn)染性能研究
　　精氨酸、殼聚糖及精氨酸-殼聚糖多聚物的紅外光譜(FT

10、IR)及1H核磁圖譜(1HNMR)見(jiàn)圖1-3。在精氨酸的紅外譜圖中，1558.53 cm-1處的吸收帶是由于精氨酸的胍基所產(chǎn)生，而1474.47 cm-1處的吸收帶是由羰基COO-的伸縮振動(dòng)所引起。1136.63 cm-1和793.87 cm-1處的吸收帶分別屬于C-C-N鍵的伸縮振動(dòng)和羰基COO-的彎曲振動(dòng)。在殼聚糖的紅外譜圖中，在1655.66 cm-1處出現(xiàn)殼聚糖C=O?；膹澢駝?dòng)帶，1077.49 cm-1-1026.23 c

11、m-1處出現(xiàn)吡喃環(huán)C-O鍵的伸縮振動(dòng)帶。在精氨酸-殼聚糖多聚物的紅外譜圖中，1543.65 cm-1及1149.80 cm-1處出現(xiàn)了精氨酸的特征峰，同時(shí)也出現(xiàn)了殼聚糖吡喃環(huán)上的C-O鍵的特征性伸縮振動(dòng)帶，而在1462.91 cm-1處出現(xiàn)的吸收帶是因精氨酸與殼聚糖相互反應(yīng)生成的酰胺鍵而產(chǎn)生。1H NMR核磁圖譜進(jìn)一步顯示，精氨酸-殼聚糖多聚物中同時(shí)出現(xiàn)精氨酸與殼聚糖的特征性吸收峰。根據(jù)以上FTIR及1H NMR結(jié)果可看出精氨酸已成功接

12、枝于殼聚糖的骨架中。
　　透射電鏡可見(jiàn)，Arg-CS/pBMP-2納米粒子呈球形，粒徑較為均一。同時(shí)可見(jiàn)，裸質(zhì)粒DNA電泳出加樣孔，而Arg-CS/pBMP-2納米粒能阻滯pBMP-2向陽(yáng)極移動(dòng)。加入不同濃度的DNA酶后，裸質(zhì)粒DNA被降解，其泳道內(nèi)條帶基本消失，而Arg-CS/pBMP-2納米粒泳道內(nèi)的熒光亮度基本不變。由此可見(jiàn)，Arg-CS基因載體能成功與BMP-2質(zhì)?；蚰鄢杉{米級(jí)粒子，并有效保護(hù)其內(nèi)的質(zhì)?；蚩笵NA酶降

13、解。
　　MC3T3-E1細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染后72h后，Arg-CS/pBMP-2納米粒組在熒光顯微鏡下有較多的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，殼聚糖/pBMP-2納米粒組只有少數(shù)細(xì)胞表達(dá)弱的綠色熒光，而裸質(zhì)粒DNA組只有極個(gè)別的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白蛋白陽(yáng)性(圖1-7)。同時(shí)，western blot顯示Arg-CS/pBMP-2納米粒組的BMP-2蛋白的表達(dá)水平明顯高于殼聚糖/pBMP-2納米粒組(p＜0.05)及裸質(zhì)粒DNA組(p＜0.01)

14、。
　　2.包封精氨酸-殼聚糖/pBMP-2納米粒的PELA微囊的制備、表征及其緩釋能力研究
　　掃描電鏡可見(jiàn)微球的形態(tài)，圖2-1A所示:微球呈現(xiàn)橢圓形或規(guī)則圓形，表面光滑、無(wú)粘連、大小分布較均勻尺寸約為43.34±15.24μm。
　　圖2-1B可見(jiàn)，在開(kāi)始2天內(nèi)有累計(jì)16.46±4.73％的pBMP-2被釋放，之后pBMP-2的緩釋保持在相對(duì)較平穩(wěn)的速率。緩慢釋放2周后，pBMP-2釋放速度呈現(xiàn)小幅加速。緩釋3周后

15、，pBMP-2緩釋速度又逐漸減慢。到實(shí)驗(yàn)終止時(shí)（第42天），pBMP-2累積釋放56.87±5.09％?？梢?jiàn)，本研究制備的PELA微球能夠滿足長(zhǎng)效緩釋的要求。同時(shí)，測(cè)得包封率為67.49±0.85％。
　　包封納米粒的PELA微球與MC3T3-E1細(xì)胞共培養(yǎng)后分別于3、7、10、14、18、21天行ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液BMP-2蛋白分泌量，由圖2-1，在第7天，PELA/Arg-CS/BMP-2組的BMP-2蛋白分泌達(dá)到最高48.

16、35±3.38 pg/ml，21天后BMP-2蛋白的分泌量仍能達(dá)到較高水平29.09±1.87 pg/ml。
　　3.包封精氨酸-殼聚糖/pBMP-2納米粒的PELA微囊體外成骨誘導(dǎo)效能的研究
　　圖3-3可見(jiàn)PELA/Arg-CS/pB MP-2納米粒組的鈣結(jié)節(jié)沉積明顯多于其它處理組，同時(shí)ALP活性分析顯示，在培養(yǎng)第7天，PELA/Arg-CS/pBMP-2納米粒組的ALP活性均高于其它處理組(P＜0.05)，PELA/C

17、S/pBMP-2納米粒組與PELA/pBMP-2組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而PELA微球組與PELA/pBMP-2組的ALP活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。到第14天，PELA/Arg-CS/pBMP-2納米粒組的ALP活性大于PELA/CS/pBMP-2組(P＜0.05)，PELA/pBMP-2組(P＜0.01)和PELA組(P＜0.01)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PELA/CS/pBMP-2組的ALP活性高于PELA

18、/pBMP-2組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　本研究將精氨酸修飾的殼聚糖作為BMP-2質(zhì)粒基因的載體，進(jìn)而提高BMP-2基因的入胞性能及促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)BMP-2蛋白的高表達(dá)水平。同時(shí)制備的包封Arg-CS/pBMP-2納米粒子的PELA微球也實(shí)現(xiàn)對(duì)Arg-CS/pBMP-2納米粒子的長(zhǎng)效緩釋?zhuān)龠M(jìn)成骨前體細(xì)胞的成骨分化，這為其今后臨床治療骨缺損提供了重要依據(jù)。然而，活體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜多變，在體內(nèi)多種因素影響下