基于PRLR-JAK-STAT5信號傳導(dǎo)通路測定鵝催乳素的新方法研究.pdf

1、催乳素（Prolactin，PRL）是具有廣泛生理功能的一種激素。在禽(鳥)類中，是促進(jìn)母禽(鳥)就巢行為發(fā)生和調(diào)控生殖活動的關(guān)鍵激素之一。就巢期PRL表達(dá)量升高抑制垂體促性腺激素的分泌，使得禽類卵泡停止發(fā)育并終止產(chǎn)蛋，從而形成固定的就巢行為。禽類就巢行為已成為現(xiàn)代養(yǎng)禽業(yè)中制約禽類繁殖性能和飼養(yǎng)效益提高的重要限制因素。PRL也是研究鵝反季節(jié)繁殖技術(shù)中的關(guān)鍵激素之一。不同濃度PRL對禽類生殖活動的調(diào)控表現(xiàn)出不同的作用，因此，準(zhǔn)確測定不同繁

2、殖周期中血漿PRL濃度尤為必要。為準(zhǔn)確測定鵝PRL（goose PRL,gPRL）濃度，本研究設(shè)計了基于PRLR-JAK-STAT5信號通路測定gPRL的新方法。
　　本試驗首先從健康產(chǎn)蛋鵝卵巢組織提取核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，RT-PCR技術(shù)克隆了鵝催乳素受體基因(Prolactin receptor,PRLR)CDS區(qū)序列，并在該序列末尾添加6xHis標(biāo)簽，將加標(biāo)簽后的序列插入到真核表達(dá)載體pCMV

3、6-Entry的Hind III和XhoI酶切位點中，構(gòu)建成為重組載體 pCMV6-PRLR-His-Entry，并將其瞬時轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，培養(yǎng)30h后，用碧云天蛋白裂解液裂解經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞并收集細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，利用Western-blot驗證轉(zhuǎn)染的pCMV6-PRLR-His-Entry中重組PRLR-His蛋白在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　然后人工合成了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(Signal tra

4、nsducer and activator of transcription5,STAT5)信號應(yīng)答序列。同時將鵝PRLR基因CDS區(qū)序列和STAT5序列分別插入到真核表達(dá)載體pCMV6-Entry和熒光素酶報告載體pGL3-Enhancer的KpnI和XhoI酶切位點中，構(gòu)建成為信號接收載體pCMV6-PRLR-Entry和信號應(yīng)答載體pGL3-(STAT5)5-Enhancer。然后將上述兩載體同內(nèi)參載體pRL-TK瞬時轉(zhuǎn)染到HEK

5、293T細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h后加PRL至終濃度分別為0ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL和120ng/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h并通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)測定細(xì)胞中熒光素酶（Luciferase，Luc）相對活性的變化。
　　將pCMV6-PRLR-Entry和pGL3-(STAT5)5-Enhancer同含有增強(qiáng)綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)報告基因

6、和嘌呤霉素篩選基因的載體pEZX-MR03均線性化后共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，經(jīng)嘌呤霉素篩選30d后，挑取單克隆細(xì)胞，并擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞株。提取轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞株基因組脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)，通過普通PCR分別驗證pCMV6-PRLR-Entry和pGL3-(STAT5)5-Enhancer在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株基因組中的穩(wěn)定整合，共篩選出10株成功整合有全部轉(zhuǎn)基因載體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克

7、隆細(xì)胞株。擴(kuò)大培養(yǎng)篩選出的成功整合有pCMV6-PRLR-Entry和pGL3-(STAT5)5-Enhancer的單克隆細(xì)胞株，添加PRL至終濃度分別為0ng/mL、30ng/mL、60ng/mL和90ng/mL，繼續(xù)培養(yǎng)6h后提取細(xì)胞RNA，通過熒光實時定量PCR(Quantitative real time PCR，QRT-PCR)測定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株中Luc基因相對表達(dá)量的變化，同時通過單熒光素酶檢測系統(tǒng)測定單克隆細(xì)胞中Luc的活性