斑馬魚毒-效聯(lián)合評價法在抗骨質疏松中藥研究中的應用.pdf

1、本研究在課題組前期成功建立斑馬魚骨質疏松模型的基礎上，進一步聯(lián)合斑馬魚毒性模型，即成斑馬魚毒/效聯(lián)合評價法，并將其用于骨碎補配伍代表壯骨藥如淫羊藿、續(xù)斷和代表活血藥如丹參、三七的安全性和壯骨活性，以期為兼顧有效性與安全性的抗骨質疏松中藥高效評價提供思路與方法。此外，本研究應用斑馬魚模型高效追蹤壯骨關節(jié)丸的抗骨質疏松活性藥味。
　　1.用斑馬魚毒/效聯(lián)合評價法研究骨碎補配伍壯骨或活血中藥的規(guī)律
　　(1)斑馬魚毒性模型評價藥味

2、/組分配伍前后的安全性
　　斑馬魚毒性模型主要觀察給藥后3天的斑馬魚魚體形態(tài)和顯微檢視結果，并記錄給藥后每天的胚胎死亡數(shù)目，計算給藥后6天的藥物對斑馬魚胚胎的半數(shù)致死濃度(LC50)。斑馬魚毒性模型成功評價了代表壯骨類中藥骨碎補、淫羊藿、續(xù)斷和代表活血類中藥丹參、三七及其有效組分的毒性大小，并比較了骨碎補與淫羊藿、骨碎補與丹參、淫羊藿與丹參不同配伍比例的安全性大小。
　　單味藥提取物安全性大小順序（以LC50值比較）為:骨碎

3、補50％醇提物（6826μg/mL）＞淫羊藿70％醇提物(1275.25μg/mL)＞丹參水提物(875.43μg/mL)＞三七水提物(135.86μg/mL)＞續(xù)斷水提物(14.227μg/mL)。
　　單味藥的組分安全性大小順序為:骨碎補總黃酮(545.4μg/mL)＞丹參總酚酸提取物(37.3μg/mL)＞淫羊藿總黃酮(35μg/mL)＞三七總皂苷(12μg/mL)＞丹參酮提取物(5.3μg/mL)＞續(xù)斷總皂苷(1.6μg/

4、mL)。
　　選取毒性較小的藥味依照臨床用量比例進行配伍，發(fā)現(xiàn)骨碎補50％醇提物與淫羊藿70％醇提物及骨碎補50％醇提物與丹參水提物配伍過程中，隨著骨碎補50％醇提物在配伍中的含量增多，其安全性隨之增高，但當其含量達到一定比例時，安全性最高，繼續(xù)增加其比例，安全性反而降低。
　　毒性較小的藥味有效成分配伍，骨碎補總黃酮與淫羊藿總黃酮及骨碎補總黃酮與丹參總酚酸提取物配伍，結果表明有效組分配伍同樣使骨碎補總黃酮的LC50值降低，

5、毒性增強。
　　(2)斑馬魚骨質疏松模型評價藥味/組分配伍前后的有效性
　　選取毒性較小的藥物進行抗骨質疏松活性研究的配伍，按照前期課題組斑馬魚骨質疏松模型的步驟，以斑馬魚頭骨茜素紅染色面積和累計光密度為指標，通過顯微檢視圖像計算各藥物配伍前后抗骨質疏松活性的起效濃度。
　　斑馬魚骨質疏松模型同樣成功評價了上述各藥物及有效組分的抗骨質疏松活性，并篩選了骨碎補50％醇提物與淫羊藿70％醇提物生藥比為4∶4和5∶4的比例配

6、伍活性最好;骨碎補50％醇提物與丹參水提物生藥比為1∶1時配伍起效劑量最低;淫羊藿50％醇提物與丹參水提物生藥比為2∶1和3∶1時配伍效果較優(yōu)。在有效組分配伍中，壯骨類成分淫羊藿總黃酮和活血類成分丹參總酚酸提取物與骨碎補總黃酮配伍能夠降低骨碎補總黃酮起效的濃度，減少骨碎補總黃酮用量，起到了協(xié)同增效的功用。
　　2.斑馬魚骨質疏松模型篩選壯骨關節(jié)丸中主要藥味的抗骨質疏松活性
　　用斑馬魚毒/效聯(lián)合評價法篩選壯骨關節(jié)丸中各藥味的

7、毒性與抗骨質疏松活性，依照上述步驟進行。各藥味的安全性實驗由課題組其余人員進行，本研究主要負責主要藥味的藥效活性篩選部分，結果顯示中成藥壯骨關節(jié)丸的組成藥味中，補骨脂水提物、淫羊藿水提物、續(xù)斷水提物、骨碎補水提物、狗脊水提物、熟地黃水提物和雞血藤水提物能夠對抗?jié)娔崴升堈T導的斑馬魚骨質疏松;桑寄生水提物、木香水提物、乳香/沒藥水提物、獨活水提物不能夠對抗?jié)娔崴升堈T導的斑馬魚骨質疏松。
　　斑馬魚毒/效聯(lián)合評價法能夠成功實現(xiàn)中藥及復方